分子生物学-基因的表达与调控上.pptx

6基因的表达与调控基因的表达与调控(上上)原核基因表达调控模式原核基因表达调控模式v原核生物细胞:v v 基因和蛋白质种类较少v v 如大肠杆菌基因组约为4.60 x106bp共有4288个可读框。v 据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子，如果每个基因等同翻译的话，任何一个多肽应有2500个拷贝。v 但是，这些蛋白质并不是以相同拷贝数存在于每个细胞中的，有些蛋白质的数目相当固定，另一些则变化很大。v 每个大肠杆菌细胞可以有约15000个核糖体，与其结合的约50种核糖体蛋白，数量也是十分稳定的。糖酵解体系的酶含量很大，其数目也极恒定。v如DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中十分必需的酶或蛋白质，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质被称为组成型(constitutive)合成蛋白质。v另一种类型的蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变，被称为适应型或调节型（adaptive or regulated)蛋白质。v 一般情况下，一个大肠杆菌细胞中只有15个分子的-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。v 其他参与糖代谢的酶，氨基酸、核苷酸合成系统的酶类，其合成速度和总量都随培养条件的变化而改变。v细菌中所利用的大多数基本调控机制一般执行如下规律：v 一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。是通过调节转录来建立的，也就是说在mRNA的合成水平上调节。v 实际上，当我们说一个系统处于关闭状态时，也可能有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子和极少量的蛋白质分子。表示是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。6 61 1 原核基因表达调控总论原核基因表达调控总论v基因表达：v 从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression）v 对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。vv rRNA rRNA、tRNAtRNA编码基因转录合成编码基因转录合成RNARNA的过程也属于的过程也属于基因表达。基因表达。v 基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。组成性表达(constitutive expression)适应性表达(adaptive expression）基因表达的方式基因表达的方式 1 1、组成性表达：组成性表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。指不大受环境变动而变化的一类基因表达。某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为通常被称为管家基因管家基因(housekeeping gene)(housekeeping gene)。2 2、适应性表达、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。达。v 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为，这类基因被称为可诱导的基因可诱导的基因(inducible gene)；v 相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏称为阻遏(repression)，相应的基因被称为，相应的基因被称为可阻遏的基可阻遏的基因因(repressible gene)。基因表达的规律基因表达的规律 时间性和空间性时间性和空间性1、时间特异性（、时间特异性（temporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性时间特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特阶段特异性异性(stage specificity)。2、空间特异性、空间特异性(spatial specificity)基基因因表表达达伴伴随随时时间间顺顺序序所所表表现现出出的的这这种种分分布布差差异异，实实际际上上是是由由细细胞胞在在器器官官的的分分布布决决定定的的，所所以以空空间间特特异异性性又又称称细细胞胞或或组组织织特特异异性性(cell or tissue specificity)。在在个个体体生生长长全全过过程程，某某种种基基因因产产物物在在个个体体按按不不同同组组织织空空间间顺顺序序出出现现，称称之之为为基基因因表表达达的的空空间间特异性特异性。基因表达调控的生物学意义基因表达调控的生物学意义v适应环境、维持生长和增殖（原核、真核）维持个体发育与分化（真核）v基因表达调控主要表现：基因表达调控主要表现：v (1)转录水平上的调控v (transcriptional regulation)；v (2)转录后水平上的调控v (post transcriptional regulation)v转录后水平上的调控包括:v mRNA加工成熟水平上的调控v (differential processing of RNA transcript)；v 翻译水平上的调控v (differential translation of mRNA)。v原核生物中v 营养状况(nutritional status)v 环境因素(environmental factor)v 对基因表达起着举足轻重的影响。v真核生物尤其是高等真核生物中v 激素水平(hormone level)v 发育阶段(developmental stage)v 是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。v原核:v 转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相偶联。v真核生物:v 转录产物只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。6.1.1 原核基因调控机制的类型与特点v原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。v根据调控机制的不同可分为：v 负转录调控(negative transcription regulation)v 正转录调控(positive transcription regulation)v在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor)，起着阻止结构基因转录的作用。v 根据其作用特征又可分为:v 负控诱导v 负控阻遏v 二大类。v在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物(诱导物)结合时，结构基因不转录；v 在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。v 阻遏蛋白作用的部位是操纵区。v在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)。v根据激活蛋白的作用性质分为:v 正控诱导系统v 正控阻遏系统。v 在正控诱导系统中，效应物分子(诱导物)的存在使激活蛋白处于活性状态；v 在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。转录水平上调控的其他形式转录水平上调控的其他形式1.因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。参与大肠杆菌基因表达调控最常见的蛋白质是因子。v温度较高,诱导产生各种热休克蛋白 由32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境需要 枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达v除参与氮代谢的54以外，其它5种因子在结构上具有同源性，所以统称70家族。v 所有因子都含有4个保守区，其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA解开成单链的过程。v 大多数因子特异性结合DNA上的-35区和-10区，而54因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合。v在与启动子结合的顺序上:v 70类启动子在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子区相结合v 54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白(TBP)，可以在无核心酶时独立结合到启动子上。v通过特殊代谢物调节的基因活性主要有两大类：v 可诱导v 可阻遏v(1)可诱导调节：v 是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。v 大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中生长良好，在只含乳糖的培养基中开始时生长不好，直到合成了利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源的能力才开始生长。v 细菌在诱导物乳糖的诱导下开动了乳糖操纵子，表达它所编码的3个酶：v -半乳糖苷酶(使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖)v -半乳糖苷透过酶(使乳糖进入细菌细胞内)v -半乳糖苷乙酰基转移酶(使-半乳糖第六位碳原子乙酰化)。v在葡萄糖培养基中生长时，每个细胞只有几个-半乳糖苷酶分子，但若转移到乳糖培养基中，几分钟后，每个细菌细胞内可产生3000个酶分子。v 因此，这类基因被称为可诱导基因v 这类酶被称为诱导酶v 这个生化过程被称为酶的诱导合成。v(2)可阻遏调节：v 这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。v 大肠杆菌生活中必须有色氨酸，一般情况下，色氨酸操纵子是开启的。v 如果在细菌培养基中加入色氨酸，使之能利用培养基中的色氨酸来维持生活而不需要再费力去合成，细菌往往能在2-3 min内完全关闭该操纵子。v某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以被这个产物本身所关闭。v 这种基因被称为可阻遏基因v 这些酶被称为可阻遏酶v 这个现象被称为可阻遏现象v 这些起阻遏作用的小分子被称为阻遏物。v一般规律：v 可诱导的操纵子总是一些编码糖和氨基酸分解代谢蛋白的基因，这些糖和氨基酸平时含量很少，细菌总是利用更一般的能源物质葡萄糖的水解来提供能源，因此，这些操纵子常常是关闭的。v 一旦生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖作为能源时，就要打开这些基因。v可阻遏基因是一些合成各种细胞代谢过程中所必须的小分子物质(如氨基酸、嘌呤和嘧啶等)的基因，由于这类物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的。v 只有当细菌生活环境中有充分供应时，才关闭这些基因，停止其合成。6 61 12 2 弱化子对基因活性的影响弱化子对基因活性的影响v大肠杆菌中色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子等的调节方式是通过弱化子调节的。v 在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。v 当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时。v 起终止转录信号作用的那一段核苷酸起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子。v 因为核糖体在基因转录产物上的不同位置，决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构、并由此决定基因能否继续转录。v 起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶的浓度浓度，因此是转录调节中的微调整，只要稍加变动就可影响整个体系的功能。v属于这种调节方式的有:v大肠杆菌中的色氨酸操纵子v苯丙氨酸操纵子v苏氨酸操纵子v异亮氨酸操纵子v缬氨酸操纵子v沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等。6 61 13 3 降解物对基因活性的调节降解物对基因活性的调节v操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中解脱出来进行转录，是从负调节的角度来考虑基因表达调控的。v 如何通过正调节以提高基因的转录水平，使它由原来的低水平表达变成高水平表达，这就是降解物抑制作用的调节。v有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。因为添加葡萄糖后，细菌所需要的能量便可从葡萄糖得到满足，细菌无需开动一些不常用的基因去利用那些稀有的糖类。v葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活性，减少cAMP的合成v 与它相结合的蛋白质环腺苷酸受体蛋白CRP（又称分解代谢物激活蛋白CAP）因找不到配体而不能形成复合物。v 降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。6 61 14 4 细菌的应急反应细菌的应急反应v在所谓“正常”，也包括生活环境中缺少某一种或两种能源，细菌能找到其他代用物，进行正常生活条件下的基因表达调节。v 可是，细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一二种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。v 实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)。v 产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。v当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。v ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。v 关于ppGpp的作用原理还不大清楚。v一般认为RNA聚合酶有不同的构象，这些构象可以识别不同的启动子区，ppGpp与RNA聚合酶结合会使它的某些构象稳定下来，从而改变了基因转录的效率。v 也有人认为基因转录起始位点附近有一些保守序列，它们可能是ppGpp或有关调节蛋白的结合位点。当这些序列与ppGpp结合后，就不能与RNA聚合酶相结合，使基因被关闭。v ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。1 1、操纵子模型的提出、操纵子模型的提出 1961 1961年，年，MonodMonod和和JacobJacob提出提出 获获19651965年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖6 62 2 乳糖操纵子与负控诱导系统乳糖操纵子与负控诱导系统Jacob and Monod2、操纵子的定义、操纵子的定义操纵子操纵子：是基因表达的协调单位，由是基因表达的协调单位，由启动子启动子、操纵基操纵基因因及其所控制的一组功能上相关的及其所控制的一组功能上相关的结构基因结构基因所组所组成。成。操纵基因受调节基因产物的控制。操纵基因受调节基因产物的控制。v大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子（基因）和阻遏子等。v 转录时，RNA聚合酶首先与启动区(promoter，P)结合，通过操纵区(operator，O)向右转录。v 转录从O区中间开始，按Z-Y-A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。v 转录的调控是在启动区和操纵区进行的。v3 3个结构基因各决定一种酶：个结构基因各决定一种酶：v Z 编码-半乳糖苷酶：v Y 编码-半乳糖苷透过酶：v A 编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：v -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷。v -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷(如乳糖)透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内，所以，如果用乳糖为大肠杆菌生长的惟一碳源和能源，这两种酶是必需的。v -半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的利用中并非必需。6 62 21 1 酶的诱导酶的诱导laclac体系受调控的证据体系受调控的证据v在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有1-2个酶分子。v 但是，如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6或7，每个细胞中可有超过105个酶分子。v当有乳糖供应时，在无葡萄糖培养基中生长的lac+细菌中将同时合成-半乳糖苷酶和透过酶。v 培养基中加入乳糖1-2min后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就迅速增加。v 去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降到几乎无法检测到，表明乳糖确实能激发lac mRNA的合成。v研究诱导作用时很少使用乳糖，因为培养基中的乳糖会被诱导合成的-半乳糖苷酶所催化降解，从而使其浓度不断发生变化。v v实验室里常常使用两种含硫的乳糖类似物:v 异丙基巯基半乳糖苷(IPTG)v 巯甲基半乳糖苷(TMG)。v 另外，在酶活性分析中常用，发色底物O-硝基半乳糖苷(ONPG)，它们都是高效诱导物。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物(gratuitous inducer)。v 如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物.v同位素实验证明，酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。v已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lac mRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，为分两类：I型和O型。v I型：野生型为I+，突变型为I-O型：野生型为O+，突变型为Oc。v I+I-或O+Oc后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达，所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。v I基因是一个产生阻遏物的调节基因，其产物使体系关闭。I-突变体由于不能产生阻遏物，使细胞成为lac永久表达型。I-/I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物，使细胞中的lac仍然被抑制。v遗传学图谱分析指出，Oc突变位于I与Z之间，所以，lac体系的4个基因的序列为IOZY。v 通过这些观察，Jacob和Monod推断Oc突变代表DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个基因，因为可编码的基因具有互补性，而Oc没有这一特性。v O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是永久型合成，O区域称为操纵基因。6 62 22 2 操纵子模型及其影响因子操纵子模型及其影响因子v1961年Jacob和Monod发表lac操纵子负控诱导模式，建立了乳糖操纵子的控制模型，其主要内容如下：v (1)Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；v(2)该mRNA分子的启动区(P)位于阻遏基因(I)与操纵区(O)之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达；v (3)操纵区是DNA上的一小段序列（长26bp?,35bp)，是阻遏物的结合位点；(4)当阻遏物与操纵区相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制；(5)诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵区相结合，从而激发lac mRNA的合成。这就是说，有诱导物存在时，操纵区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的转录。v首先，诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合v 而转运诱导物需要透过酶v 透过酶的合成又需要诱导。v 第一个诱导物是如何达到细胞内的？1lac操纵子的本底水平表达影响因子影响因子v两种可能：v 一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞；v 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成。v v 研究表明，第二种解释是正确的。v其次，人们发现乳糖(葡萄糖-1，4-半乳糖)并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是乳糖的异构体异构乳糖(葡萄糖-1，6-半乳糖).v 而异构乳糖是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。v 因此，乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成需要有-半乳糖苷酶的预先存在。v解释：v 在非诱导状态下有少量的lac mRNA合成(大约每个世代中有1-5个mRNA分子)，这种合成被称之为本底水平的组成型合成(background level constitutive synthesis)。v v 由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的，即使在它与操纵基因紧密结合时，也会偶尔掉下来；这时启动子的障碍被解除，RNA聚合酶开始转录。这种现象以每个细胞周期1-2次的概率发生。v细菌生长在以甘油为碳源的培养基中，按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内可有几个分子的-半乳糖苷酶和乳糖透过酶。v 现在加入乳糖，在单个透过酶分子作用下，少量乳糖分子进入细胞，又在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成异构乳糖。v 某个异构乳糖与结合在操纵区上的阻遏物相结合并使后者失活而离开操纵区，开始lac mRNA的生物合成。v 这些mRNA分子编码了大量的-半乳糖苷酶和乳糖透过酶，其结果导致乳糖大量涌入细胞。2 2大肠杆菌对乳糖的反应大肠杆菌对乳糖的反应v多数乳糖被降解成为葡萄糖和半乳糖，但还有许多乳糖被转变成异构乳糖，然后与细胞内的阻遏物结合(虽然合成速度低，但是阻遏物仍继续合成，因此必须有足够的异构乳糖才能使细胞维持去阻遏状态)，阻遏物的失活促使mRNA高速合成，进一步提高了透过酶和-半乳糖苷酶的浓度。v 降解产生的葡萄糖被细胞用作碳源和能源，降解产生的半乳糖则被另一套酶体系转变成葡萄糖，这些酶的合成也是可诱导的。v一旦培养基和细胞中的所有乳糖都被消耗完毕，由于阻遏物仍在不断地被合成，有活性的阻遏物浓度将超过异构乳糖的浓度，使细胞重新建立起阻遏状态，导致lac mRNA合成被抑制。v在细菌中，多数mRNA的半衰期只有几分钟，所以在不到一个世代的生长期内，lac mRNA几乎从细胞内消失。-半乳糖苷酶及透过酶的合成也趋向停止，这些蛋白质虽然很稳定，但其浓度随着细胞的分裂而不断被稀释。v 如果在原有的乳糖被撤去之后的一个世代中再加入乳糖，这时乳糖可以立即开始降解，因为此时细胞内仍有一定浓度的透过酶和-半乳糖苷酶。v lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合。v 未经分级分离的细胞提取物的结合能力大约为每细胞结合20-40个IPTG分子，因此推测每个细胞中有5-10个阻遏物分子。观察发现在I I-突变株细胞提取物中缺少阻遏物，从而证明与IPTG结合的物质确实是蛋白质。v 当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。3阻遏物lac I基因产物及功能v -半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下再转化成葡萄糖)。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子。v 研究发现，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的。v 如在一个大肠杆菌突变体，它在糖酵解途径中不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，这些细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，我们说不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应(catabolite repression)。4葡萄糖对lac操纵子的影响v在大肠杆菌中，cAMP的浓度受到葡萄糖代谢的调节。v 如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP浓度就高；v 如果在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；v 如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度也会很高。v 因此推测糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶活性的抑制剂。5cAMP与代谢物激活蛋白ZYAOPDNA 调控区调控区CAP结合位点结合位点启动序列启动序列操纵序列操纵序列 结构基因结构基因Z：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y：透酶透酶A：乙酰基转移酶：乙酰基转移酶cAMPCAP复合物v大肠杆菌中的代谢物激活蛋白v 由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。v 凡Crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成lac mRNA，CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的。v cAMP-CRP复合物是激活lac的重要组成部分，细菌对于此复合物的需要是独立的，与阻遏体系无关，转录必须有cAMP-CRP复合物结合在DNA的启动子区域上。v Crp基因和环化酶基因的突变细菌即使同时也是I-或Oc突变，都不能合成出lac mRNA。v 所以，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。v半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均转化生成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，所以，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导的操纵子控制的。只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达，被称为降解物敏感型操纵子(catabolite sensitive operon)。v 实验证明这些操纵子都是由cAMP-CRP调节的。对大量操纵子启动区的研究表明，CRP-cAMP结合位点存在序列特异性。v cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lac mRNA合成起始所必需的。v 该复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。v 而阻遏物则是一个抗解链蛋白(antimelting protein)，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。623lac操纵子操纵子DNA的调控区的调控区P、O区区v已经分离得到含有lac操纵子的DNA片段，发现P区(即启动子区)一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bpv 而O区(即阻遏物结合区)位于-7+28位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。v 实验表明，阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动区结合形成转录起始复合物的效率。6 62 24 4 laclac操纵子中的其他问题操纵子中的其他问题v1A基因及其生理功能 v A基因存在于lac操纵子中，编码了-半乳糖苷乙酰基转移酶。v 虽然乳糖本身不能被乙酰化，但这个酶能够把乙酰基从供体上转移到半乳糖苷分子上。v自然界中存在着许多种能被-半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子，它们的分解产物往往不能被进一步代谢，很容易在体内积累。这是非常有害的，因为不少半乳糖苷衍生物在高浓度时是细胞正常生长的抑制物。v 当有IPTG存在时,I-OcA-大肠杆菌的生长速度显著慢于相应的A+株系，两组细胞的差异仅仅在于后者能将IPTG乙酰化，而乙酰化的IPTG不能被-半乳糖苷酶所分解。v 所以，A基因虽然不在乳糖降解中起作用，但它抑制了-半乳糖苷酶产物的有害性衍生物在细胞内积累，在生物进化中是有意义的。v在一个完全被诱导的细胞中，-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2。这个比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作为惟一碳源时细胞的需要。v 不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。v 这种调节有以下两种方式：2 2laclac基因产物数量上的比较基因产物数量上的比较v(1)lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。v 这种现象发生的频率取决于每一个后续的AUG密码子再度起始翻译的概率。因此，就存在着一个从mRNA的5末端到3末端的蛋白质合成梯度。v 对于大多数多顺反子mRNA分子来说，这种现象具有普遍性。v(2)在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。v 事实上，对于某个活跃表达的多顺反子操纵子，该mRNA所编码的各种蛋白质的相对浓度都由每一个顺反子的翻译频率所决定。C ABA:RNA polymeraseB:lac repressor C:CRP-cAMP6 63 3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统色氨酸操纵子与负控阻遏系统v 由于trp体系参与生物合成不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。v 色氨酸的合成主要分5步完成，每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。一、色氨酸操纵子的结构一、色氨酸操纵子的结构 调控基因调控基因 结构基因结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸的酶催化分枝酸转变为色氨酸的酶trpRtrpv共有7个基因参与了色氨酸合成过程，编码了与色氨酸合成有关的5个酶：v trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶v trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶v trpF编码异构酶v trpC编码吲哚甘油磷酸合酶v trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。v 在大肠杆菌等许多细菌中，trpE和trpG融合成一个功能基因，trpC和trpB也融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。v 除上述7个基因之外，细菌中还有：v pabA，pabB基因分别编码ADC合酶的两个亚基v pabC基因编码ADC裂解酶v ubiC基因编码分枝酸裂解酶v entC基因编码异构分枝酸合酶v 这些基因产物都在不同程度上参与了分枝酸代谢，与色氨酸合成有一定关系。v trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpE紧邻的是启动子区和操纵区。v 另外，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa(不是trpA)。v trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25 min处，而前者则位于90 min处。v 在位于65 min处还有一个trpS(色氨酸tRNA合成酶)，它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。trp操纵子的转录调控除了阻遏系统以外，还有弱化系统。L区编码了前导肽，当有高浓度Trp存在时，由于弱化子a的作用，转录迅速减弱停止，生成140核苷酸的前导RNA；当Trp浓度较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成长约7kb的mRNA，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG在+162处。v特点:(1)trpR和trpABCDE不连锁；(2)操纵基因在启动子内(3)有衰减子(attenuator)/弱化子(4)启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开 631 trp操纵子的阻遏系统操纵子的阻遏系统v trpR基因突变常引起trp mRNA的组成型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白(aporepressor)。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。v 辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合开关闭trp mRNA转录。v 这个系统中的效应物分子是色氨酸，是由trp操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。v 当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结合；v 当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子去阻遏。色氨酸供应短缺时，基因活化色氨酸供应短缺时，基因活化色氨酸过剩时，与阻遏因子结合，抑制基因转录色氨酸过剩时，与阻遏因子结合，抑制基因转录低低TrpTrp时：时：阻遏物不结合阻遏物不结合操纵基因操纵基因;高高TrpTrp时：时：阻遏物阻遏物+Trp +Trp 结合操纵基因结合操纵基因632弱化子与前导肽弱化子与前导肽v6.3.2.1 弱化子v 阻遏不是惟一的调节机制。v 在色氨酸高浓度和低浓度下观察到trp操纵子的表达水平相差约600倍，然而阻遏作用仅使转录降低70倍。v 此外，使阻遏物失活突变不能完全消除色氨酸对trp操纵子表达的影响。v 显然，trp操纵子的这种调控与阻遏物的控制无关，必然还有其他调控机制。通过缺失突变株的研究发现，这种调控机制就是弱化作用(attenuation)。1、弱化子：DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（123-150区）。123150v阻遏-操纵机制对色氨酸来说只是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于trp操纵子的粗调开关。v trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细调控并决定已经启动的转录是否继续下去。在这个系统中，酶的浓度根据氨基酸浓度的变化而受到调节。v 这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，细胞中色氨酸的浓度是实现过早终止的根本原因。v在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中123-150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。v 当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123-150区序列缺失会提高trp基因表达的原因。v 因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。v 研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。6322前导肽前导肽v实验表明衰减作用需要负载tRNATrp参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了。v 分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA；如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸的多肽。这个假设的多肽被称为前导肽。v 有证据表明事实上可能存在这个多肽，因为在该AUG位点5上游端有一个核糖体结合位点，而前导肽编码区与trpE基因5端融合可产生一种融合蛋白质，该蛋白质具有与前导肽同样的N末端序列。v前导序列具有一个非常有意义的特点:v在其第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。在组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有7个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有7个苯内氨酸密码子。这些密码子参与了trp及其他操纵子中的转录弱化机制。6323mRNA前导区的序列分析前导区的序列分析vtrp前导区的碱基序列的4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。vRNase T1降解实验(此酶不能水解配对的RNA)表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式;v 由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。6324转录弱化作用转录弱化作用v转录的弱化理论认为:mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。v 因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。v 当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNAtrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区(或停留在两个相邻的Trp密码子处)，这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。The trp Attenuator:3、弱化机制、弱化机制v而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。v所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。v 已从大肠杆菌和沙门氏菌中陆续发现了不少具有弱化作用的操纵子，它们都具有前导肽，并且前导肽中都富含该操纵子所合成的那种氨基酸。633 trp操纵子弱化机制的实验依据操纵子弱化机制的实验依据v在含有较高浓度色氨酸的培养基中，色氨酰-tRNA合成酶缺陷型大肠杆菌中trp操纵子结构基因的表达却并没有完全受到抑制。v 进一步研究温度敏感突变株trpS5证实，它所编码的Trp-tRNA合成酶只在30时有活性，能使色氨酸活化生成tRNAtrp，在42时该酶没有活性。v比较野生型和突变型在42和30条件下有色氨酸供应时邻氨基苯甲酸合酶(TrpE)的活性发现:v30时，色氨酰-tRNA合成酶有活性，可生成tRNATrp，trp操纵子结构基因的表达受抑制；v在42时，色氨酰-tRNA合成酶失去活性，不能生成tRNATrp，trp结构基因表达受抑制的程度就不明显。v野生型大肠杆菌色氨酰-tRNA合成酶不受温度控制，所以trp基因表达基本不受温度影响。v研究另一个前导区及研究另一个前导区及D基因缺失的基因缺失的trp操纵子突变体操纵子突变体(trpLD102)还发现，该细菌在补充了