343微生物制药.pptx

第二章第二章 微生物制药微生物制药一、微生物药物的几个相关基本概念一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护七、废弃物的综合利用和环境保护四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（一）药物的产生菌（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（二）新药产生菌的分离（三）新微生物药物的筛选（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏（五）微生物药物产生菌的保藏（三）新微生物药物的筛选（三）新微生物药物的筛选1、初筛发酵、初筛发酵初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基成分培养基成分碳源碳源糖类、脂肪、某些有机糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物酸、醇或碳氢化合物供给微生物生命活动所需要供给微生物生命活动所需要的能量以及构成菌体细胞成的能量以及构成菌体细胞成分和代谢产物。分和代谢产物。氮源氮源蛋白胨、黄豆饼粉、花蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥酒泥硫酸铵、氨水、硝酸盐硫酸铵、氨水、硝酸盐等等供给微生物生长所需的氮素，供给微生物生长所需的氮素，构成菌体原生质构成菌体原生质无机无机盐、盐、微量微量元素元素磷、镁、钾、钠等磷、镁、钾、钠等铁、铜、锌、锰、钴、铁、铜、锌、锰、钴、钼等钼等可以作为生理活性物质的组可以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物成或生理活性作用的调节物初筛方式：初筛方式：固体平板发酵固体平板发酵液体振荡培养液体振荡培养便于大量筛选抗菌物质时采用。便于大量筛选抗菌物质时采用。放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。有利于放线菌生长和抗生素的合成。2、筛选模型的研究与应用、筛选模型的研究与应用10000株新分离的放线菌株新分离的放线菌30株（可能是新抗生素）株（可能是新抗生素）10种新化合物种新化合物1种有希望的化合物，低毒性，体内有效种有希望的化合物，低毒性，体内有效新抗生素新抗生素/分离的菌株数：分离的菌株数：1/1000新抗生素新抗生素/已知抗生素：已知抗生素：1/50有希望的抗生素有希望的抗生素/分离的菌株数：分离的菌株数：1/100002500株对细菌有抗菌活性株对细菌有抗菌活性500株株250株链丝菌素类株链丝菌素类125株链霉素类株链霉素类40株四环素类株四环素类55株其他已知抗生素株其他已知抗生素交叉耐药试验和纸层鉴别交叉耐药试验和纸层鉴别WWo oo od dr ru uf ff f等等等等的的的的经经经经典典典典筛筛筛筛选选选选毒性试验毒性试验（1）常规的筛选方法）常规的筛选方法琼脂扩散法琼脂扩散法利用利用多种微生物多种微生物作为检定菌，作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。筛选有抗菌活性的物质。v非致病菌非致病菌v抗生素耐药突变株和超敏菌株抗生素耐药突变株和超敏菌株v厌氧菌厌氧菌v协同活性检测协同活性检测（2）定靶筛选）定靶筛选从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。耐药菌有效、毒性小的新抗生素。q以作用机理为依据的筛选方法以作用机理为依据的筛选方法q以耐药机制为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法细细菌菌细细胞胞壁壁合合成成抑抑制制剂剂的的筛筛选选土壤分离的微生物（土壤分离的微生物（10200株）（细菌、真菌和放线菌）株）（细菌、真菌和放线菌）第二步：第二步：测定抑制同位素渗入测定抑制同位素渗入meso-3H二氨基庚二酸二氨基庚二酸L-14C亮氨酸亮氨酸用用Diaflo UM-2膜测定相膜测定相对分子质量（对分子质量（1000以下）以下）小分子量：小分子量：azureomycin A和和B（新）（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素，青霉素G大分子量：大分子量：ristocetin A 和和B其他（其他（11种）种）+-+-+（487）（238）（1530）+-+-+第一步：第一步：抗微生物活性：细菌抗微生物活性：细菌支原体支原体细胞壁合成抑制剂细胞壁合成抑制剂（141）asukamycinSetomimycinvineomycinsnanaomycinA、B、C、D、Efreonolicin Bcervinomycins其他其他q以耐药机制为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用，引起抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用，引起细菌耐药性的增加，而细菌耐药机制的研究进细菌耐药性的增加，而细菌耐药机制的研究进展又使耐药性的解决成为可能。展又使耐药性的解决成为可能。细菌的耐药机制主要有细菌的耐药机制主要有4 4种：种：A.A.细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；B.B.抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降；的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降；C.C.由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变；变；D.D.细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制，它能够细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制，它能够把进入胞内的药物泵至胞外。把进入胞内的药物泵至胞外。-内内酰酰胺胺酶酶抑抑制制剂剂的的筛筛选选-内酰胺酶内酰胺酶是一类能够破坏具有是一类能够破坏具有-内酰胺结构抗生素的内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生钝化酶的总称。许多致病菌由于产生-内酰胺酶而对青内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。霉素和头孢菌素具有抗性。-内酰胺酶抑制剂的筛选内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制主要依据抑制剂抑制-内酰胺内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解酶，使酶失去活性，不能水解-内酰胺类抗生素，使抗内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。耐药菌株平板法耐药菌株平板法液体测定法液体测定法联合使用联合使用-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株内酰胺酶以及敏感和耐药突变株通过颜色变化来检测通过颜色变化来检测-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂诱导诱导-内酰胺酶方法的应用内酰胺酶方法的应用3、高通量筛选、高通量筛选高通量筛选（高通量筛选（high throughput screening）技术是）技术是20世纪世纪80年年代后期形成的寻找新药的高新技术。代后期形成的寻找新药的高新技术。将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，可以实现大规模的筛选。后用计算机记录结果，并进行分析，可以实现大规模的筛选。高通量筛选的模型：高通量筛选的模型：细胞模型细胞模型观察待测样品对细胞的作用，反映观察待测样品对细胞的作用，反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正常细胞和病理细胞。常细胞和病理细胞。分子模型分子模型包括受体、酶等，药物作用的靶点包括受体、酶等，药物作用的靶点明确。明确。其他模型其他模型现阶段的微生物药物筛选主要研究方面：现阶段的微生物药物筛选主要研究方面：a)产生菌的来源产生菌的来源b)微生物的初筛发酵微生物的初筛发酵c)新的筛选模型和方法新的筛选模型和方法四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（一）药物的产生菌（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（二）新药产生菌的分离（三）新微生物药物的筛选（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏（五）微生物药物产生菌的保藏目的目的将产生菌的一些有益变异，通过不断将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。要的高产优质新菌种。（四）微生物药物产生菌的菌种改良（四）微生物药物产生菌的菌种改良v自然选育自然选育v诱变育种诱变育种v杂交育种杂交育种v基因工程技术改良菌种基因工程技术改良菌种1 1、自然选育、自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然选育或自然分离。自然分离。自然选育包括自然选育包括v从自然界分离获得菌株从自然界分离获得菌株v根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。1 1）从自然界分离获得菌株）从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅）试验方案设计试验方案设计采样采样第一次增殖培养第一次增殖培养第一次平板分离第一次平板分离第二次增殖培养第二次增殖培养第二次平板分离第二次平板分离第二次原种斜面第二次原种斜面初筛（初筛（1株株1瓶）瓶）增殖条件摸索增殖条件摸索第一次原种斜面第一次原种斜面定性或半定量测定定性或半定量测定定性或半定量测定定性或半定量测定第三次平板分离第三次平板分离第三次原种斜面第三次原种斜面复筛（复筛（1株株3-5瓶）瓶）第四次平板分离第四次平板分离第四次原种斜面第四次原种斜面再复筛再复筛较优化菌株较优化菌株1-3株株初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索第三次原种保藏第三次原种保藏种子培养种子培养不纯不纯不纯不纯保藏及进一步做生产性能试保藏及进一步做生产性能试保藏及进一步做生产性能试保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株验或作为育种的出发菌株验或作为育种的出发菌株验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验等某些必要试验和毒性试验等2 2）从自发突变体中获得菌株）从自发突变体中获得菌株u变异是育种的基础。变异是育种的基础。变异是育种的基础。变异是育种的基础。u自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。u自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在留在留在留在“选选选选”种，还要进行种，还要进行种，还要进行种，还要进行“育育育育”种。种。种。种。如通过诱变如通过诱变如通过诱变如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株株株株诱变育种。诱变育种。诱变育种。诱变育种。2 2、诱变选育、诱变选育人工诱变人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。作相配合才能受到良好的效果。诱变育种的主要环节：诱变育种的主要环节：以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中体中DNADNA碱基变异频率大幅度提高；碱基变异频率大幅度提高；用合适的方法淘汰负效应变异株，选出用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。育优良菌株的目的。a.出发菌株的选择出发菌株的选择b.菌悬液的制备菌悬液的制备c.前培养前培养d.诱变诱变e.变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选1）诱变剂）诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂生物诱变剂生物诱变剂各种射线，如紫外线、各种射线，如紫外线、X射线、射线、射线、射线、射线、射线、射线和超射线和超声波等声波等乙基磺酸乙酯（乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。亚硝酸、氮芥等。噬菌体、转座因子噬菌体、转座因子防护面罩防护衣防护罩各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂诱变剂的剂量诱变剂的剂量处理时间处理时间缓冲剂缓冲剂中止反应方法中止反应方法亚硝酸（亚硝酸（HNO2）0.010.1mol/L510minpH值值4.5，1mol/L醋醋酸缓冲液酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠磷酸二氢钠硫酸二乙酯硫酸二乙酯（DES）0.511030min，孢子孢子1824hpH值值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯（EMS）0.050.5mol/L1060min，孢子孢子36hpH值值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释亚硝基胍亚硝基胍（NTG）0.11.0 mol/mL，孢子孢子3mg/mL1560min，90120minpH值值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或磷酸缓冲液或Tris缓缓冲液冲液大量稀释大量稀释亚硝基甲基胍亚硝基甲基胍（NMU）0.11.0 mol/mL1590minpH值值6.07.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂磷酸缓冲剂或或Tris缓冲液缓冲液大量稀释大量稀释氮芥氮芥0.11.0 mol/mL510minNaHCO3甘氨酸或大量甘氨酸或大量稀释稀释乙烯亚胺乙烯亚胺1:10001:100003060min硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释羟胺羟胺（NH2OHHCl）0.10.5数小时或生长过程数小时或生长过程中诱变中诱变大量稀释大量稀释氯化锂（氯化锂（LiCl）0.30.5加入培养基中，在加入培养基中，在生长过程中诱变生长过程中诱变大量稀释大量稀释秋水仙碱秋水仙碱（C22H25NO6）0.010.2加入培养基中，在加入培养基中，在生长过程中诱变生长过程中诱变大量稀释大量稀释2）影响诱变效果的因素）影响诱变效果的因素出发菌株的遗传特性；出发菌株的遗传特性；诱变剂；诱变剂；菌种的生理状态；菌种的生理状态；被处理菌株的预培养和后培养条件；被处理菌株的预培养和后培养条件；诱变处理时的外界条件等。诱变处理时的外界条件等。a)选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株b)采用分散状态的孢子悬浮液处理采用分散状态的孢子悬浮液处理c)采用单核细胞（或核质体）处理采用单核细胞（或核质体）处理d)注意微生物的生理状态注意微生物的生理状态e)适宜的诱变剂量适宜的诱变剂量3 3）筛选的方法）筛选的方法制定筛选方案制定筛选方案制定筛选方案制定筛选方案方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。出发菌种（砂土管或冷冻管）出发菌种（砂土管或冷冻管）斜面斜面或肉汤培养或肉汤培养24 h单孢子悬液单孢子悬液 诱变处理诱变处理稀释涂布平板稀释涂布平板挑取单菌落传种斜面挑取单菌落传种斜面菌悬液菌悬液诱变处理诱变处理诱变处理诱变处理处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率观察单菌落形态并统计其形态变异率观察单菌落形态并统计其形态变异率摇瓶初筛摇瓶初筛挑出高产斜面挑出高产斜面菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子）菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子）摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定）摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定）挑出高产菌株挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察作稳定性试验和菌种特性考察放大试验罐、中试考察放大试验罐、中试考察大型投产试验大型投产试验传种斜面（或直接用固体孢子）传种斜面（或直接用固体孢子）传种斜面（或直接用固体孢子）传种斜面（或直接用固体孢子）对照组对照组对照组对照组突变株的筛选方法突变株的筛选方法突变株的筛选方法突变株的筛选方法一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法影印接种法等。等。影印平板（影印平板（Replica platingReplica plating）法是）法是LederbergLederberg夫妇在夫妇在19521952年建立年建立用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产菌株用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产菌株代谢产物代谢产物产生菌产生菌抗代谢物抗代谢物肌苷肌苷Bacillus pumilus（短小芽胞杆菌）（短小芽胞杆菌）8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤肌苷肌苷Corynebacterium sp（一种棒状杆菌）（一种棒状杆菌）6-硫鸟嘌呤硫鸟嘌呤腺嘌呤腺嘌呤Salmonella typhimarium（鼠伤寒沙门氏菌）（鼠伤寒沙门氏菌）2，6-二氨基嘌呤二氨基嘌呤烟碱酸烟碱酸Chlamydomonas eugametos（一种衣藻）（一种衣藻）3-乙酰吡啶乙酰吡啶色氨酸色氨酸Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）（伤寒沙门氏菌）6-甲基色氨酸甲基色氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸Escherichia coli（大肠杆菌）（大肠杆菌）乙硫氨酸乙硫氨酸酪氨酸酪氨酸E.coli对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸吡咯叠氮吡咯叠氮（pyrrolnitrin）Pseudomonas aureofaciens（金色假单胞菌）（金色假单胞菌）6-氟色氨酸氟色氨酸亮氨酸亮氨酸S.typhi三氟三氟-DL-亮氨酸亮氨酸根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。摇瓶筛选法摇瓶筛选法琼脂块筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化筛选自动化和筛选工具微型化随机筛选随机筛选理性化筛选理性化筛选运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。产突变株。理性化筛选理性化筛选初级代谢产物高产菌株的筛选：初级代谢产物高产菌株的筛选：a.降低终产物浓度降低终产物浓度b.筛选抗反馈突变菌株筛选抗反馈突变菌株次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选：次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选：a.利用营养缺陷型筛选利用营养缺陷型筛选b.筛选负变株的回复突变株筛选负变株的回复突变株c.筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株d.筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株e.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株f.筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株g.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株h.筛选自身所产的抗生素抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株降低终产物浓度降低终产物浓度杂交育种杂交育种杂交育种杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。菌株。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。3 3、杂交育种、杂交育种1）常规的杂交育种）常规的杂交育种a)遗传标记遗传标记b)异核体形成异核体形成c)杂合二倍体的形成杂合二倍体的形成d)染色体交换和单倍体染色体交换和单倍体2）原生质体融合）原生质体融合A.A.标记菌株的筛选标记菌株的筛选u供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。以利于融合子的选择。u采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。状为标记。u通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。进行较细的筛选。B.B.B.B.原生质体的制备原生质体的制备原生质体的制备原生质体的制备在高渗透压溶液中，用在高渗透压溶液中，用在高渗透压溶液中，用在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶适当的脱壁酶适当的脱壁酶适当的脱壁酶去除细胞壁，去除细胞壁，去除细胞壁，去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。（细菌或放线菌可用（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素溶菌酶或青霉素处理，处理，酵母菌和霉菌可用酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）溶菌酶溶菌酶蜗牛酶蜗牛酶影响原生质体制备的因素：影响原生质体制备的因素：菌体的预处理菌体的预处理菌体的预处理菌体的预处理菌体的培养时间菌体的培养时间菌体的培养时间菌体的培养时间酶浓度酶浓度酶浓度酶浓度酶解温度酶解温度酶解温度酶解温度酶解时间酶解时间酶解时间酶解时间渗透压稳定剂渗透压稳定剂渗透压稳定剂渗透压稳定剂用用EDTA、甘氨酸、青霉素或、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。一般控制在一般控制在2040。充足的酶解时间充足的酶解时间vv对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；vv对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；vv对于霉菌则采用对于霉菌则采用对于霉菌则采用对于霉菌则采用KClKCl和和和和NaClNaCl等。一定浓度的等。一定浓度的等。一定浓度的等。一定浓度的CaCa2+2+、MgMg2+2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。C.C.原生质体的融合和再生原生质体的融合和再生u融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和和Ca2+作用下，作用下，发生原生质体的融合。发生原生质体的融合。u原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。影响原生质体融合的因素：影响原生质体融合的因素：菌体的前处理；菌体的前处理；菌体的培养时间；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；阳离子的浓度；融合的温度；融合的温度；融合体系的融合体系的pH值等。值等。影响原生质体再生的因素：影响原生质体再生的因素：菌种自身的再生性能；菌种自身的再生性能；原生质体制备的条件；原生质体制备的条件；再生培养基成分；再生培养基成分；再生培养条件等。再生培养条件等。检查原生质体形成和再生的指标：检查原生质体形成和再生的指标：v原生质体的形成率原生质体的形成率v原生质体的再生率原生质体的再生率将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A；将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：a.用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B；b.用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。原生质体形成率原生质体形成率A BA100原生质体再生率原生质体再生率C BAB100D.D.融合子的选择融合子的选择l融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。l在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。l在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。原生质体融合与传统杂交方法相比有以下几个特点：原生质体融合与传统杂交方法相比有以下几个特点：1、重组频率高并可能有几个亲株同时进行杂交；、重组频率高并可能有几个亲株同时进行杂交；2、可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体，但重组、可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体，但重组 的频率比较低；的频率比较低；3、被灭活的原生质体进行融合后，仍可能活的重组体；、被灭活的原生质体进行融合后，仍可能活的重组体；4、原生质体的形成与再生本身就可作为链霉菌的一种育种方、原生质体的形成与再生本身就可作为链霉菌的一种育种方 法。法。4 4、基因工程技术改良菌种、基因工程技术改良菌种体外重组体外重组DNADNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。而发展起来的一门新兴技术。它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。（1）DNA重组过程重组过程基因的分离基因的分离DNA分子的切割与连接分子的切割与连接载体载体引入宿主细胞引入宿主细胞重组体的选择和鉴定重组体的选择和鉴定外源基因的表达外源基因的表达（2）重组）重组DNA技术在微生物药物菌种改良技术在微生物药物菌种改良研究中的应用研究中的应用A.提高微生物药物的单位产量提高微生物药物的单位产量1.增加限速酶基因拷贝数增加限速酶基因拷贝数,提高菌种的生产能力提高菌种的生产能力2.引入抗性基因和调节基因引入抗性基因和调节基因,增加微生物药物单位产量增加微生物药物单位产量3.克隆抗生素的全部结构基因克隆抗生素的全部结构基因,改变表达体系提高产量改变表达体系提高产量C.构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌 许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化学修饰获得的，但是制备工艺较为复杂。例如半合成头孢学修饰获得的，但是制备工艺较为复杂。例如半合成头孢菌素的中间体是头孢菌素菌素的中间体是头孢菌素C的衍生物的衍生物7-ACA，或青霉素，或青霉素G和和V的衍生物的衍生物7-ADOCA。B.阻断支路代谢，增加有效组分的含量阻断支路代谢，增加有效组分的含量 抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建阿弗米阿弗米丁是十六元大环内酯的齐墩果二糖衍生物，由除虫链丁是十六元大环内酯的齐墩果二糖衍生物，由除虫链霉菌产生，在发酵过程中还产生一种结构差别大的大霉菌产生，在发酵过程中还产生一种结构差别大的大环内酯类抗生素寡霉素。环内酯类抗生素寡霉素。D.构建产生新化合物的基因工程菌构建产生新化合物的基因工程菌 由于许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强，由于许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强，当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生物合成途径有关的抗生素产生菌中，可使其产生不同于物合成途径有关的抗生素产生菌中，可使其产生不同于二亲株产物的具有生物活性的新化合物，即二亲株产物的具有生物活性的新化合物，即“杂合抗生杂合抗生素素”。例如，将放线紫红素的生物合成基因导入紫红链。例如，将放线紫红素的生物合成基因导入紫红链霉菌，产生了新化合物二氢榴菌紫红素；聚酮类化合物霉菌，产生了新化合物二氢榴菌紫红素；聚酮类化合物（PK）。）。E.引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状 充足的氧气供给是稳定和提高发酵工业生产水平、降充足的氧气供给是稳定和提高发酵工业生产水平、降低生产成本的关键，传统方法是改良生物反应器及增大低生产成本的关键，传统方法是改良生物反应器及增大通气量。专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白通气量。专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白（VHb），能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上，使细），能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下也能很好生长。胞在贫氧状态下也能很好生长。四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（一）药物的产生菌（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（二）新药产生菌的分离（三）新微生物药物的筛选（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏（五）微生物药物产生菌的保藏1 1 1 1、菌种保藏的目的、菌种保藏的目的、菌种保藏的目的、菌种保藏的目的按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般使用多种方法保存）。使用多种方法保存）。使用多种方法保存）。使用多种方法保存）。（五）微生物药物产生菌的保藏（五）微生物药物产生菌的保藏2 2 2 2、菌种保藏的基本原理、菌种保藏的基本原理、菌种保藏的基本原理、菌种保藏的基本原理n微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。n干燥、低温、隔绝空气是保证获得这种状态干燥、低温、隔绝空气是保证获得这种状态干燥、低温、隔绝空气是保证获得这种状态干燥、低温、隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。的主要措施。的主要措施。的主要措施。3 3菌种的保藏菌种的保藏菌种的保藏菌种的保藏l l有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是微生物菌种保藏的基本技术。微生物菌种保藏的基本技术。微生物菌种保藏的基本技术。微生物菌种保藏的基本技术。l保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽胞等），保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽胞等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方也应考虑到经济、简便方法。法。l由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，法保藏较好，要根据具体情况而定。要根据具体情况而定。3 3 3 3、菌种保藏的技术、菌种保藏的技术、菌种保藏的技术、菌种保藏的技术4 4、菌种保藏方法、菌种保藏方法A.暂时保存（斜面传代保藏法暂时保存（斜面传代保藏法）把菌种接种到所需要的斜面培养基上，置最适温度下把菌种接种到所需要的斜面培养基上，置最适温度下把菌种接种到所需要的斜面培养基上，置最适温度下把菌种接种到所需要的斜面培养基上，