细菌内毒素检查法讲义新乡市食品药品药品检验所.pptx

l简况简况l历史回顾与发展趋势历史回顾与发展趋势l细菌内毒素细菌内毒素l鲎试剂检测内毒素的机理鲎试剂检测内毒素的机理 l20102010年版药典细菌内毒素检查法介绍年版药典细菌内毒素检查法介绍一、简况一、简况 一一百百多多年年前前，在在西西方方医医学学发发展展史史上上，一一个个最最重重要要的的发发展展就就是是注注射射给给药药（特特别别是是静静脉脉注注射射）方方式式的的创创立立。毫毫无无疑疑问问它它在在人人类类与与疾疾病病作作斗斗争争的的过过程程中中起起了了重重要要作作用用，但但是是无无论论过过去去还还是是现现在在，临临床床上上使使用用注注射射剂剂时时经经常常出出现现注注射射引引起起的的发发热热、头头痛痛、恶恶心心、肤肤色色灰灰白白、昏昏迷迷等等，甚甚至至导导致致患患者者死死亡亡，这这些些反反应应总总称称为为不不良良反反应应。不不良良反反应应可可分分为为热热原原反反应应和和过过敏敏反反应应。因因此此，注注射射剂剂的的热热原原检检查查是是保保证证药药品品安安全全的的重重要要检检验验项项目之一。目之一。1912 1912年第一次考虑用家兔做热原试验，年第一次考虑用家兔做热原试验，19421942年美国首先将家兔热原检查方法收入药年美国首先将家兔热原检查方法收入药典。中国药典于典。中国药典于19531953年开始收载。因此，半年开始收载。因此，半个世纪以来，家兔法对保证药品临床使用的安个世纪以来，家兔法对保证药品临床使用的安全发挥了重要的作用。但是，随着科学技术和全发挥了重要的作用。但是，随着科学技术和制药工业的发展，这一检查法的制药工业的发展，这一检查法的局限性局限性越来越越来越明显，所以用新的检验方法代替家兔法检测热明显，所以用新的检验方法代替家兔法检测热原早已成为国内外医药界科研、生产、临床检原早已成为国内外医药界科研、生产、临床检验等部门很紧迫的问题，基于科学实践发展的验等部门很紧迫的问题，基于科学实践发展的要求从而发现并建立了细菌内毒素检查方法。要求从而发现并建立了细菌内毒素检查方法。细菌内毒素试验方法有：细菌内毒素试验方法有：凝胶法（凝胶法（Gelation assayGelation assay）属限量；属限量；浊度法（浊度法（Turbidimetrec assayTurbidimetrec assay）属定量；属定量；显色底物法（显色底物法（Chromogenic assayChromogenic assay）属定量法；属定量法；免疫方法（免疫方法（Immumology assayImmumology assay）等。等。历史回顾和发展趋势历史回顾和发展趋势1、历史回顾历史回顾 美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。19561956年年，美美国国动动物物学学家家F.BangF.Bang发发表表论论文文鲎鲎的的一一种种细菌性疾病，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。细菌性疾病，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。19641964年年，F.BangF.Bang和和J.levinJ.levin提提出出了了鲎鲎血血凝凝集集的的初初步步机机理。理。1968 1968年，年，F.BangF.Bang和和J.levinJ.levin建立了鲎试验的方法。建立了鲎试验的方法。19731973年年，美美国国食食品品药药物物管管理理局局（FDAFDA）承承认认鲎鲎试试剂剂为一种生物制品。为一种生物制品。19801980年年，FDAFDA制制定定了了用用鲎鲎试试剂剂检检查查人人用用和和兽兽用用注注射射药药内内毒毒素素的的准准则则；美美国国药药典典2020版版（USPXXUSPXX）收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法（BETBET），但在药典各品种正文中未涉及。但在药典各品种正文中未涉及。19831983年年，USPXXUSPXX版版第第四四增增补补本本规规定定了了注注射射用用水水等等5 5种种常常用用药药品品和和4040种种放放射射性性药药品品用用细细菌菌内毒素检查取代热原检查。内毒素检查取代热原检查。19911991年年，USPXXUSPXX版版第第五五增增补补本本规规定定185185种药品以细菌内毒素检查取代热原检查。种药品以细菌内毒素检查取代热原检查。19951995年年，USPXXUSPXX版版规规定定471471种种药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法检检查查，保保留留热热原原检检查查的的药药品品不足不足3030种。种。19991999年年，USPXXUSPXX版版规规定定670670种种药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法检检查查，保保留留热热原原检检查查的的药药品品约约2020种。种。20002000年年，国国际际调调和和委委员员会会使使美美国国药药典典（USPUSP）、欧欧洲洲药药典典（EPEP）和和日日本本药药局局方方（JPJP）达达成成BETBET的的国国际际调调和和案案，统统一一的的BETBET已已收收载载于于USPXXUSPXX和和NF19NF19的的第第二二增增补补本中，并于本中，并于20012001年年1 1月月1 1日生效。日生效。英英国国、欧欧洲洲药药典典以以及及日日本本药药局局方方都都已已收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，但但规规定定检检查查的的品品种种各各有有不不同同。一一个个共共同同的的特特点点是是注注射射水水是是最最先先被被允允许许检检查查的的品种。品种。中中国国目目前前是是世世界界上上鲎鲎试试剂剂产产量量最最大大的的国国家家之之一。一。1975 197519821982年是我国鲎试剂的研制阶段，年是我国鲎试剂的研制阶段，当时由于缺乏标准化研究的基础，上千批次的当时由于缺乏标准化研究的基础，上千批次的实验结果难于分析。实验结果难于分析。19831983年，卫生部授权国家药品生物制品检年，卫生部授权国家药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验的协作研究。的协作研究。19881988年年，卫卫生生部部颁颁布布细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，允允许许4 4种药品使用细菌内毒素检查法初检。种药品使用细菌内毒素检查法初检。19931993年年，中中国国药药典典19901990年年版版第第二二增增补补本本收收载载细菌内毒素检查法，但未涉及任何品种正文。细菌内毒素检查法，但未涉及任何品种正文。19951995年年，“中中国国药药典典细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法实实施施会会议议纪纪要要”提提出出争争取取在在3 35 5内内我我国国上上百百种种药药品品由热原检查法改为细菌内毒素检查法。由热原检查法改为细菌内毒素检查法。19961996年年，中中国国药药典典19951995年年版版二二部部附附录录收收载载经经修修订订的的细细菌菌内内的的毒毒素素检检查查法法，注注射射用用水水等等五五种种常常用用药药品品和和九九种种放放射射性性药药品品正正文文规规定定了了细细菌菌内内毒毒素素检检查查，取取消消了了热热原原检检查查（其其中中5%5%及及10%10%葡葡萄萄糖糖注注射液是后来发通知补充）。射液是后来发通知补充）。19981998年年，中中国国药药典典19951995年年版版19981998年年增增补补本本收收载载经经重重大大修修订订的的细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，其其中中对对鲎鲎试试剂剂和和细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水的的质质量量以以及及细细菌菌内内毒毒素素检查方法提出了更高要求。检查方法提出了更高要求。20002000年年，中中国国药药典典20002000年年版版（二二部部）新新增增细细菌菌内内毒毒素素检检查查品品种种5757种种，且且收收载载了了细菌内毒素检查法应用指导原则。细菌内毒素检查法应用指导原则。2002005 5年，中国药典年，中国药典2002005 5年版（二部）年版（二部）新增细菌内毒素检查品种约新增细菌内毒素检查品种约200200种。种。2 2、发展趋势、发展趋势 A.A.各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势 细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为官方承认的一种法定的药检方法，反映了药典标为官方承认的一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着时间的推移，药工业水平及药品质量的提高。随着时间的推移，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。B.细菌内毒素检查取代热原检查成为必然的趋势细菌内毒素检查取代热原检查成为必然的趋势 细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法所所具具有有的的优优点点表表明明它它比比热热原原检检查查法法更更适适应应现现代代制制药药工工业业的的发发展展。从从USPXXUSPXX版版开开始始收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，到到USPXXUSPXX版版已已有有超超过过90%90%的的注注射射剂剂品品种种规规定定内内毒毒素素检检查查。其其它它国国家家的的药药典典规规定定细细菌菌内内毒毒素素检检查查的的品品种种同同样样经经历历了了从从无无到到有有，从从少少到到多多的的过过程程。可可以以预预见见，细细菌菌内内毒毒素素检检查查最最终终必必然然会会取取代代绝绝大大多多数数注注射射剂剂品品种的热原检查。种的热原检查。C.C.走向统一的细菌内毒素检查法走向统一的细菌内毒素检查法 USPUSP、EPEP和和JPJP是是三三个个收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法（BETBET）较较早早的的药药典典，它它们们分分别别建建立立了了各各自自的的内内毒毒素素标标准准物物和和BETBET，WHOWHO为为了了保保持持内内毒毒素素的的国国际际标标准准品品（ISIS）的的效效价价（IUIU）与与各各国国内内毒毒素素标标准准品品的的效效价价（EUEU）的的一一致致性性，进进行行了了内内毒毒素素ISIS国国际际协协作作研研究究，自自此此，内内毒毒素素的的标标准准在在IUIU与与EUEU之之间间实实现现了了统统一一，即即1 1IU=1EUIU=1EU。虽虽然然内内毒毒素素标标准准初初步步实实行行了了统统一一，但但在在不不同同的的药药典典方方法法下下测测定的内毒素值仍有差别。定的内毒素值仍有差别。细菌内毒素细菌内毒素 细菌内毒素是细菌内毒素是细菌毒素细菌毒素的一类，的一类，是革兰氏阴性菌细是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白）和微量蛋白（Protein）的复合物，它不是细菌或细菌的代谢产物，而）的复合物，它不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡并解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活是细菌死亡并解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁中，其化学成份主要是由壁中，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。三部分组成。l类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。由于类脂A是由4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素是极为不稳定的。这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。l内毒素具有多种生物活性：内毒素具有多种生物活性：l1 1生物活性：它具有致热性、致死性毒性、生物活性：它具有致热性、致死性毒性、白细胞减少、降低血压，休克、激活凝血系白细胞减少、降低血压，休克、激活凝血系统、诱导机体对内毒素的耐受性、鲎细胞溶统、诱导机体对内毒素的耐受性、鲎细胞溶解物的凝集、刺激淋巴细胞有丝分裂、诱导解物的凝集、刺激淋巴细胞有丝分裂、诱导抗感染的非特异抵抗力、肿瘤细胞坏死作用抗感染的非特异抵抗力、肿瘤细胞坏死作用等一系列生物活性。等一系列生物活性。l2 2耐热性：细菌内毒素具有很强的耐热性，耐热性：细菌内毒素具有很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需一般的高压灭菌不能使其灭活，需2503025030分分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为用具的灭菌处理为2503025030分钟以上，而日本分钟以上，而日本药局方采用药局方采用25012501小时以上。小时以上。l其它各国药典也大多如此，国内细菌内毒素标其它各国药典也大多如此，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用用250 30250 30分钟以上的干烤处理。分钟以上的干烤处理。3 3外界因素影响：细菌内毒素的生物活性外界因素影响：细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大。目前已经知随外界因素的影响变化很大。目前已经知道，一些金属离子、超声波以及温度等都道，一些金属离子、超声波以及温度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响，会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响，据国外文献报导，据国外文献报导，铁离子铁离子、铝离子等会引、铝离子等会引起细菌内毒素活性的降低。起细菌内毒素活性的降低。因此在试验过程中最好使用玻璃用具，因此在试验过程中最好使用玻璃用具，以避免这些因素，另外温度的高低对细菌以避免这些因素，另外温度的高低对细菌内毒素水溶液活性影响很大，根据国内外内毒素水溶液活性影响很大，根据国内外文献报道：内毒素水溶液活性随着环境温文献报道：内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低，因此对于内毒素水溶液度的升高而降低，因此对于内毒素水溶液一定要在低温处保存，而且对已经稀释好一定要在低温处保存，而且对已经稀释好的内毒素水溶液，要尽可能的在的内毒素水溶液，要尽可能的在2 2小时内用小时内用完，以避免活性降低。完，以避免活性降低。鲎试剂检测内毒素的机理鲎试剂检测内毒素的机理l 1956 1956年，年，BangBang发现细菌中提取的粗发现细菌中提取的粗制品能使鲎因血细胞凝集而死亡，而肺制品能使鲎因血细胞凝集而死亡，而肺炎球菌、葡萄球菌、链球菌的提取物与炎球菌、葡萄球菌、链球菌的提取物与鲎血细胞无凝集反应。鲎血细胞无凝集反应。LevinLevin进一步从鲎进一步从鲎血变形细胞中提取了几种成分并与提纯血变形细胞中提取了几种成分并与提纯的内毒素进行凝集实验的研究，并提出的内毒素进行凝集实验的研究，并提出了内毒素的凝胶试验法。了内毒素的凝胶试验法。l鲎的种属及分布l鲎，又称作王蟹，是一种栖生于海洋中的低等无脊椎动物，大约出现在古生代泥盆纪，距今已明几亿年的历史，但直到现在它的形态并无重大变化故有“活化石”之称，鲎是从古生代的三叶虫演化而来。l鲎的种属很少，目前全世界仅存三属4种：l1.美洲鲎LimuluspolyphemusLinnaEUs分布在北美西太平洋沿岸l2.东方鲎TachyplEUstridentatusLeach分布在中国、日本、菲律宾等l3.巨鲎TachyplEUsgigasMuller分布在泰国、印度尼西亚等4.园尾鲎Carcinoscorpiusrotundicaudapocock分布马来半岛、印尼等l其中能够用于制备鲎试剂的主要有：1.美洲鲎和2.东方鲎。l鲎血呈天蓝色，是由于存在能携氧的含鲎血呈天蓝色，是由于存在能携氧的含铜血蓝蛋白铜血蓝蛋白（hemocyaninhemocyanin）所致。鲎）所致。鲎血中仅有一种白细胞，又称血中仅有一种白细胞，又称变形细胞变形细胞，它含有高密度的颗粒，颗粒中含有与内它含有高密度的颗粒，颗粒中含有与内毒素起凝集作用的酶系统，即凝固蛋白毒素起凝集作用的酶系统，即凝固蛋白原（原（CoagulogenCoagulogen）凝固酶原）凝固酶原（proclotting enzymeproclotting enzyme），），B B因子因子（factor Bfactor B）和）和C C因子（因子（factor Cfactor C）等。）等。l内毒素可使内毒素可使C C因子激活，激活的因子激活，激活的C C因子可使因子可使B B因子激活，激活因子激活，激活B B因子又可使凝固酶原活因子又可使凝固酶原活化成凝固酶，后者通过酶解作用使凝固蛋化成凝固酶，后者通过酶解作用使凝固蛋白原转变为凝固蛋白（白原转变为凝固蛋白（coagulincoagulin）。凝固）。凝固蛋白又通过交联（蛋白又通过交联（crosslinking crosslinking enzymeenzyme）作用，相互聚合而形成纤维状的）作用，相互聚合而形成纤维状的凝胶。凝胶。2010年版药典细菌内毒素年版药典细菌内毒素检查法介绍检查法介绍l整体结构整体结构l1.综述部分综述部分检查法的描述试验的准备限值（L）的确定确定最大有效稀释倍数（MVD）l2.实验部分实验部分凝胶法 光度测定法a鲎试剂灵敏度复核a标准曲线的可靠性实验b干扰实验b干扰实验c检查法：限量试验c检查法半定量试验综述部分综述部分1.检查法的描述2.试验的准备3.限值（L）的确定4.确定最大有效稀释倍数（MVD）l本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。检查法的描述检查法的描述l细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度 法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。l细菌内毒素标准物质细菌内毒素标准物质 a 国家标准品国家标准品 b 工作标准品工作标准品l细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水 a 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌的灭菌 注射用水注射用水 b 光度测定法细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于光度测定法细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于0.005EU/mll 试验的准备试验的准备 l试验器械的要求试验器械的要求试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250干烤至少30分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。试验的准备试验的准备l供试品溶液的制备供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。限值（限值（L）的确定）的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）除药典有规定的，一般按以下公式确定：LKML为供试品的细菌内毒素限值；以EU/ml、EU/mg或EU/U表示；K为规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素量；以EU/（kgh）表示。注射剂，K=5EU/（kgh），其中放射性药 品 注 射 剂，K=2.5EU/（kgh），鞘 内 用 注 射 剂，K=0.2EU/（kgh）；M为 人 用 每 公 斤 体 重 每 小 时 最 大 剂 量；以 ml/（kgh）、mg/（kgh）或u/（kgh）表示，人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计算按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。l计算举例：注射用阿莫西林钠计算举例：注射用阿莫西林钠根据国家药典委员会编纂的临床用药须知：“肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.51g，一日34次：小儿按体重每日50100mg/kg，分34次静脉滴注。”M成人1000mg/h60kg16.67mg/(kgh)M儿童100mg/(kgh)333.3mg/(kgh)L=K/M=5EU/(kgh)33.3mg/(kgh)=0.150EU/mg限值（限值（L）的确定）的确定l限值计算时做必要调整的几种情况限值计算时做必要调整的几种情况从严原则联合用药特殊情况等限值（限值（L）的确定）的确定确定最大有效稀释倍数（确定最大有效稀释倍数（MVD）l最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVDcLl L：供试品的内毒素限值l c：供试品溶液的浓度l：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度(如标准曲线为50、5、0.5EU/ml三个浓度组成)l计算举例计算举例la当L以EU/ml表示时，则浓度C的单位为1.0ml/ml适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小于xxEU/ml。ll例例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用l灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，则：MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.125EU/ml4倍确定最大有效稀释倍数（确定最大有效稀释倍数（MVD）l计算举例计算举例lb当L以EU/mg表示时，则C的单位为mg/ml或U/ml适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U。l例例：注射用阿莫西林钠l计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。l需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性内毒素的容器中，用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。l如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。MVD20mg/ml0.15EU/mg0.125EU/ml24倍l如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L；l适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。l 例例：注射用阿莫西林钠l计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。l最小有效稀释浓度lc0.125EU/ml0.15EU/mg0.833mg/mll例例：注射用青霉素钠（规格：80万单位）l限 值 为 0.01EU/100u，使 用 灵 敏 度 为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验。l最小有效稀释浓度lc0.25EU/ml0.01EU/100u2500u/ml实验部分实验部分 凝胶法凝胶法光度测定法光度测定法a鲎试剂灵敏度复核a标准曲线的可靠性实验b干扰实验b干扰实验c检查法：限量试验c检查法半定量试验l目的目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确考察检验人员操作方法是否正确实验条件是否符合规定l何时进行何时进行使用新批号的鲎试剂试验条件发生可能影响检验结果的改变时鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验 内毒素浓度20.50.25阴性对照鲎试剂平行管鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验l放入371的恒温器中，保温60分钟2分钟l将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性；l保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。l结结果果判判断断：若最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管阴性，试验方有效。l结结果果计计算算：反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值c=lg-1(X/4)式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。（反应终点浓度反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。）鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度20.50.25阴性对照终点鲎试剂平行管0.50.5c=lg-1(lg+lg+lg0.5+lg0.5)/4=0.707l当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查。实验时，以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验凝胶法干扰试验凝胶法干扰试验 目的：是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。导致干扰的因素：排除干扰的方法：pH值稀释抗凝因子中和螯合剂过滤葡聚糖加热l试验操作：试验操作：在干扰试验中，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，即与所使用的鲎试剂反应，不出现阳性的供试品溶液。凝胶法干扰试验凝胶法干扰试验 凝胶法干扰试验凝胶法干扰试验l当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。（注：须三个批号以上的供试品，两个以上鲎试剂厂家的试剂）l当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。如：内毒素检查时，供试品阳性对照为阴性时。l目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据；l优点：减少摸索过程、节省成本。预试验预试验l操作步骤操作步骤：l将供试品溶液进行一系列倍数的稀释；l使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验，每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）；l另做2支阴性对照和2支阳性对照。预试验预试验l预试验结果判断：预试验结果判断：l当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效；l当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数，即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。预试验预试验预试验阴性阳性稀释倍数原液5倍10倍20倍40倍供试品溶液PPCNCPC如上结果可初步确定该样品的最小干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。一般建议：40倍正式干扰试验正式干扰试验 l目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。l操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。编号内毒素浓度/配制内毒素的溶剂稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液12421440.5480.254C2/检查用水检查用水12421440.5480.254D无/检查用水2A：供试品溶液B：供试品阳性对照C：阳性对照D：阴性对照结果判断结果判断l当供试品阴性对照当供试品阴性对照A和阴性对照和阴性对照D都为阴性，并且都为阴性，并且系列溶液系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效。方为有效。l分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液和稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）；ES=lg-1(XS/4)Et=lg-1(Xt/4)l当ES在0.52(包括0.5和2)及Et在0.5ES2ES（包括0.5ES和2ES）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。内毒素浓度2.00.50.25终点终点内毒素/检查用水（系列溶液C）阴性对照（溶液D）内毒素/供试品溶液（系列溶液B）2.02.0供试品阴性对照（溶液A）ES=lg-1(XS/4)Et=lg-1(Xt/4)1.41l当存在干扰时，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或有关其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。导致干扰的因素：排除干扰的方法：pH值稀释抗凝因子中和螯合剂过滤葡聚糖加热检查法凝胶法检查法凝胶法l凝胶限量试验凝胶限量试验l凝胶半定量试验凝胶半定量试验凝胶限量试验凝胶限量试验l检验供试品中的内毒素含量是否小于限度的定性方法。编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A供试品溶液无/供试品溶液2B供试品阳性对照2/供试品溶液2C阳性对照2/检查用水2D阴性对照无/检查用水2当阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效例例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，计算：MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.125EU/ml4倍l供试品溶液：4倍替硝唑稀释液l供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的4倍替硝唑稀释液l阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液凝胶限量试验结果判断凝胶限量试验结果判断供试品溶液供试品溶液供试品阳性对照供试品阳性对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照 试验有效试验有效凝胶限量试验结果判断凝胶限量试验结果判断供试品溶液供试品溶液供试品阳性对照供试品阳性对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照 此批替硝唑注射液的内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定供试品溶液供试品溶液供试品阳性对照供试品阳性对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照 此批替硝唑注射液的内毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合规定凝胶限量试验结果判断凝胶限量试验结果判断供试品溶液供试品溶液供试品阳性对照供试品阳性对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照 须复试复试时，供试品溶液需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；四管中如有一管为阳性，即可判供试品不符合规定。供试品溶液供试品溶液供试品阳性对照供试品阳性对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照 凝胶半定量试验凝胶半定量试验l半定量试验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法，系通过反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。l原理：通过供试品系列稀释液与鲎试剂反应，其反应终点浓度的稀释倍数与鲎试剂灵敏度的乘积即为供试品的内毒素含量。凝胶半定量试验凝胶半定量试验l操作：用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度和稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8倍的稀释液，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD。凝胶半定量试验溶液的制备凝胶半定量试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶剂稀释用液 稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水12224282B2/供试品溶液22C2/检查用水检查用水12221240.5280.252D无/检查用水2A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液；B：供试品阳性对照（为确证不存在干扰作用）；C：标准内毒素系列（为确证本试验的操作和环境都符合规定）；D：阴性对照。凝胶半定量试验结果判断凝胶半定量试验结果判断l当阴性对照溶液D的平行管均为阴性；l供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性；l系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.52之间，则试验有效。l若内毒素浓度小于规定的限度，判供试品符合规定。l若内毒素浓度大于或等于规定的限度，判供试品不符合规定。凝胶半定量试验结果计算凝胶半定量试验结果计算内毒素浓度2.00.50.25终点标准内毒素系列溶液C0.5稀释倍数1248供试品系列溶液A42供试品阳性对照溶液B阴性对照溶液DCElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.83l例例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值为0.5EU/ml；通过使用3个鲎试剂厂家的鲎试剂对3个不同厂家的7个样品进行干扰试验证实：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀释2倍后即不干扰内毒素检查；使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂对一批右旋糖酐20葡萄糖注射液进行凝胶半定量试验。MVD0.5EU/ml0.03EU/ml16.67倍从已确定不干扰的稀释倍数2倍起，再进行1、2、4、8倍稀释(相当于将供试品原液进行了2、4、8、16倍稀释，最终的稀释倍数没有超MVD)。内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C0.0150.03稀释倍数1248供试品系列溶液A40.0320.03供试品阳性对照溶液B阴性对照溶液DCElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.830.0849EU/mll如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。由于检验时采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干扰稀释倍数2倍稀释液，因此计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数2；原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：20.0849EU/ml0.170EU/mll如试验中供试品溶液的结果均为阴性，应记为内毒素浓度小于（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于乘以该供试品的最低稀释倍数）。内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C0.0150.03稀释倍数1248供试品系列溶液A10.0310.03供试品阳性对照溶液B阴性对照溶液D原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：小于20.030.06EU/mll如试验中供试品溶液的结果均为阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以。内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C0.0150.03稀释倍数1248供试品系列溶液A80.0380.03供试品阳性对照溶液B阴性对照溶液D原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：大于80.030.48EU/ml浊浊 度度 法法显色基质法显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法分为终点浊度法和动态浊度法分为终点显色法和动态显色法检查法光度测定法检查法光度测定法终终 点点 法法动动 态态 法法 是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时浊度（或色度）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法检测反应混合物的浊度（或色度）到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度（或色度）增加速度的方法预先设定时间预先设定吸光度标准曲线的可靠性实验标准曲线的可靠性实验l当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。1.用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限；2.相邻浓度的稀释倍数应根据所检测供试品的内毒素含量确定，如不能确定，则选用宽范围的标准曲线，如比较确定，则可选择窄范围的标准曲线；标准曲线的可靠性实验标准曲线的可靠性实验3.每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管，同时要求做2支阴性管；4.当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析；5.标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效，否则，须重新试验。干扰试验干扰试验l目的：与凝胶法干扰试验相同，为确定供试品中是否存有干扰鲎试剂与内毒素反应的因素。l回收率R的意义：预先在供试品溶液中加入已知浓度的标准内毒素，将检测后计算出的内毒素与初始添加的内毒素量进行比较，根据回收的多少来判断供试品溶液中是