半薄超薄切片技术.pptx

半薄半薄/超薄切片技术超薄切片技术背景背景：肉眼肉眼光学显微镜光学显微镜透射电镜透射电镜分分辨辨率率0.2mm0.2m0.2nm应应用用范范围围可观察可观察头发丝、头发丝、双面刀双面刀刀刃的刀刃的厚度厚度可观察可观察细胞细胞的结构的结构(最大有效倍数:1000)可观察可观察细胞内细胞内的的结构结构,分辨分辨DNA、蛋白质等生物大蛋白质等生物大分子、单个金属分子、单个金属原子（原子（放大倍数可达百万倍）观察半薄切片观察半薄切片观察超薄切片观察超薄切片半薄切片超薄切片？一、超薄切片技术介绍一、超薄切片技术介绍固定地固定地好好渗透包埋地渗透包埋地好好切地切地好好载网膜做地载网膜做地好好染地染地好好超薄切片的基本要求超薄切片的基本要求:超薄切片主要步骤超薄切片主要步骤取材取材固定固定漂洗、脱水漂洗、脱水渗透、包埋渗透、包埋超薄切片超薄切片超薄切片染色超薄切片染色每一步都是关每一步都是关键键,任何任何环节的环节的疏忽疏忽都会导致都会导致制片的制片的失败失败1取材取材1.1取材的基本要求取材的基本要求(1)动作迅速动作迅速，取材后快速放入固定液中；，取材后快速放入固定液中；(2)体积要小体积要小，一般，一般13，如果来不及，例如野外取材，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（也可将组织修成（112）mm大小长条形，之后大小长条形，之后再进行分割。再进行分割。(3)减小损伤减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。挫伤与挤压组织。(4)低温操作低温操作，最好在低温，最好在低温(04)下进行，降低下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。(5)取材部位要准确取材部位要准确。1.2取材方法取材方法材料放在洁净的韧性较大的纸上材料放在洁净的韧性较大的纸上滴上预冷的固定液滴上预冷的固定液用刀片将组织切下并修小用刀片将组织切下并修小用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，经适植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。当固定后再切成小方块继续固定。2固定固定(抽气抽气)2.1固定的目的固定的目的采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。程称之为固定。目的是尽可能使细胞中的各种目的是尽可能使细胞中的各种细胞器细胞器以及以及大分子结构大分子结构保持生活状态，牢固地固定在保持生活状态，牢固地固定在它们它们原来原来所在的所在的位置位置上，不发生位移。上，不发生位移。良好的固定是获得精细结构的形态学图象良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。的关键。2.2常用固定剂常用固定剂(1)四氧化锇四氧化锇(OsO4)-OSMIUMTETRAOXIDE 强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白蛋白质、磷酸脂蛋白；固定变性固定变性DNA及核蛋白，及核蛋白，不能不能固定天然固定天然DNA、RNA及糖原；及糖原；具有具有固定固定和和电子染色电子染色双重作用，样品图象反差较好；双重作用，样品图象反差较好；酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定；酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定；与乙醇与乙醇/醛类反应生产沉淀漂洗醛类反应生产沉淀漂洗分子较大分子较大,渗透速度缓慢渗透速度缓慢,但反应迅速但反应迅速,均匀均匀固定深度固定深度0.25；固定时间一般为固定时间一般为1-2小时小时,时间太长易使组织变脆时间太长易使组织变脆,切片困难；切片困难；锇酸固定液常用浓度：锇酸固定液常用浓度：12;极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心操作要十分小心!(2)戊二醛戊二醛(C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存组织有效保存组织细微结构细微结构,对对蛋白质蛋白质的固定效果好；的固定效果好；渗透力强渗透力强,渗透速度快渗透速度快,较好的固定较好的固定糖原糖原、核蛋白核蛋白、微管微管、内质网内质网和和细胞基质细胞基质、有丝分裂的纺锤丝有丝分裂的纺锤丝及及胞饮小泡胞饮小泡等；等；保存某些保存某些酶的活力酶的活力,较好保存较好保存抗原抗原,适于细胞化学研究；适于细胞化学研究；对组织和细胞的对组织和细胞的穿透力穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度比四氧化锇强，均匀固定深度:0.51mm,04可长时间固定可长时间固定(几周甚至几周甚至12个月个月)不不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材会使组织变脆，可用于远离实验室的取材;缺点缺点:不能不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。较差，没有电子染色作用。(3)甲醛甲醛-Formaldehyde 渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；（种子）固定作用好；细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；性的保存优于戊二醛；缺点缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；部分细胞基质将丢失；常用常用多聚甲醛戊二醛多聚甲醛戊二醛的混合固定液。的混合固定液。(4)高锰酸钾高锰酸钾强氧化剂，较好固定强氧化剂，较好固定脂蛋白脂蛋白;对对神经髓鞘神经髓鞘、叶绿体叶绿体及其他各种及其他各种膜结膜结构构的研究均可作为固定剂；的研究均可作为固定剂；只用于某些常用固定剂难以固定的植只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定后固定.3漂洗、脱水漂洗、脱水3.1漂洗漂洗漂洗的目的漂洗的目的:组织固定后脱水前的漂洗组织固定后脱水前的漂洗:清除残留固定剂清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察.双重固定中双重固定中,在锇酸固定前的漂洗在锇酸固定前的漂洗:避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构饿沉淀，破坏细胞结构.常常用用缓冲液缓冲液优优点点缺缺点点pH磷酸盐磷酸盐缓冲液缓冲液对细胞无毒性作用对细胞无毒性作用,缓冲能力强缓冲能力强固定时易产生固定时易产生沉淀沉淀,易长细菌易长细菌植物材植物材料一般料一般6.87.2二甲砷二甲砷酸盐缓酸盐缓冲液冲液不易长细菌不易长细菌,与低与低浓度钙质浓度钙质1-3mM不发生沉淀反应不发生沉淀反应有毒有毒(通风橱通风橱)醋酸醋酸巴比妥巴比妥缓冲液缓冲液固定时不产生沉淀固定时不产生沉淀易长细菌易长细菌,只适只适于配锇酸固定于配锇酸固定液液,不适合配醛不适合配醛类类(缓冲失效缓冲失效)3.2脱水脱水目的目的将组织内的游离水彻底清除将组织内的游离水彻底清除,保证保证包埋介质包埋介质完全完全渗入组织内部。渗入组织内部。方法方法用一种和水及包埋剂均能相混溶的用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水液体来取代水,常用的脱水剂是常用的脱水剂是乙乙醇醇和和丙酮丙酮。注意事项注意事项脱水梯度逐级进行脱水梯度逐级进行,急剧脱水会引起细胞收急剧脱水会引起细胞收缩缩。（。（30%50%70%80%95%100%100%）;更换溶液动作要快更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透；在组织内外产生微小气泡，影响渗透；脱水过程中应在脱水过程中应在70%脱水剂中脱水剂中4停留或过停留或过夜夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难且会使样品发脆，造成切片困难;置换置换用脱水剂：环氧丙烷（用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、）、二甲苯（石蜡）。二甲苯（石蜡）。4渗透和包埋、聚合渗透和包埋、聚合4.1渗透渗透渗透就是利用渗透就是利用包埋剂包埋剂渗入到组织内部渗入到组织内部取代取代脱水剂脱水剂的过程。的过程。包埋剂在单体状态时包埋剂在单体状态时(聚合前聚合前)为液体，为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。以便进行超薄切片。4.2包埋、聚合包埋、聚合包埋操作：包埋操作：将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形成包埋块。成包埋块。包埋板包埋板1包埋管包埋管胶囊胶囊常用的包埋剂常用的包埋剂Epon812渗透效果好，切片的图像对比度强，渗透效果好，切片的图像对比度强，电子束照射下稳定电子束照射下稳定吸潮性很强，吸潮性很强，潮湿和炎热的潮湿和炎热的环境下，树脂环境下，树脂会变软会变软Spurr黏度低，可较好地渗透具有黏度低，可较好地渗透具有硬的木硬的木质化细胞壁的植物细胞质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量、脂肪含量很高的很高的内胚乳内胚乳、高度液泡化的、高度液泡化的成熟成熟果实果实,电子束照射下稳定电子束照射下稳定图像对比度较图像对比度较弱弱Araldite聚合均匀，收缩量很小，超薄切片聚合均匀，收缩量很小，超薄切片可直接沾在没有支持膜的载网上，可直接沾在没有支持膜的载网上，电子束照射下十分稳定，用重金属电子束照射下十分稳定，用重金属染色时易着色。染色时易着色。环氧树脂环氧树脂(epoxyresin)水溶性树脂丙烯酸类树脂水溶性树脂丙烯酸类树脂LRWhite、Lowicryls、GMA、PEG等，等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。制备。适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。制备。包埋操作中的注意事项包埋操作中的注意事项所有所有试剂试剂要要防潮防潮，最好存放在干燥器中；，最好存放在干燥器中；所用所用器皿器皿应烘干；应烘干；配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净.皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；5超薄切片超薄切片5.1修块修块削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成织的四周以和水平面成45度的角度削去包度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。5.2超薄切片超薄切片超薄切片机：超薄切片机：LEICAULTRACUTR超薄切片厚度超薄切片厚度:100nm,一般一般50-70nm5.3载网和支持膜载网和支持膜(1)载网载网(超薄超薄)载网载网铜网铜网(常用常用)不锈钢网不锈钢网镍网镍网(免疫电镜免疫电镜)直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm 5.3载网和支持膜载网和支持膜(2)载网支持膜载网支持膜膜的要求膜的要求:透明无结构透明无结构,并能承受电子束的轰击并能承受电子束的轰击.支持膜的种类支持膜的种类:火棉胶膜火棉胶膜聚乙烯醇缩甲醛膜聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜膜)碳膜碳膜膜的厚度膜的厚度:10nm20nm6超薄切片的染色超薄切片的染色目的目的:增强样品的反差增强样品的反差,提高图象的清晰度提高图象的清晰度.常用染色剂常用染色剂:重金属盐重金属盐各种染料各种染料常用的染色剂常用的染色剂:醋酸铀和柠檬酸铅。醋酸铀和柠檬酸铅。染色方法：染色方法：(1)组织块染色组织块染色在脱水至在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间时间2小时以上，或在冰箱中过夜。小时以上，或在冰箱中过夜。超薄切片染色超薄切片染色(2)超薄切片后染色超薄切片后染色醋酸双氧铀醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染柠檬酸铅双染铀染铀染:细胞核及结缔组织染色细胞核及结缔组织染色铅染铅染:提高细胞质成分的反差提高细胞质成分的反差1）前固定）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积）3%戊二醛戊二醛in0.1MPBS,ph7.2，室温，室温5-6h，后，后4C保存保存2）漂洗：）漂洗：0.1MPBSPh7.2充分漂洗充分漂洗3-4次，次，20-30Min/次次3）后固定）后固定1%锇酸固定锇酸固定in0.1MPBS，4Covernight4）漂洗：）漂洗：0.1MPBSPh7.2充分漂洗充分漂洗3-4次，次，20-30Min/次次5）系列脱水）系列脱水：30%-50%-70%（4C,overnight,可以停下）可以停下）-80%-95%-100%-100%）用丙酮置换乙醇：用丙酮置换乙醇：乙醇乙醇:丙酮丙酮=1:1，纯丙酮，纯丙酮2次，次，每级每级20-30分钟分钟6）渗透）渗透丙酮丙酮:树脂树脂=2:1，1:1（可以停下了，（可以停下了，overnight），1:22-3h/级级纯树脂纯树脂12h，换纯树脂换纯树脂12h（从进入树脂开始更要严格防潮！）（从进入树脂开始更要严格防潮！）7）包埋聚合）包埋聚合60C24hr注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固等水溶性树脂，固定液可以是定液可以是1.25%戊二醛戊二醛+1.25%多聚甲醛多聚甲醛in0.1MPBSPh7.2超薄切片图片超薄切片图片二、半薄切片技术介绍二、半薄切片技术介绍半薄切片主要步骤半薄切片主要步骤取材取材固定固定漂洗、脱水漂洗、脱水渗透、包埋渗透、包埋半薄切片半薄切片半薄切片染色半薄切片染色每一步都是关每一步都是关键键,任何任何环节的环节的疏忽疏忽都会导致都会导致制片的制片的失败失败FAA固定液固定液（福尔马林（福尔马林5-冰醋酸冰醋酸5-70%酒精酒精90）半薄）半薄/石蜡切片石蜡切片一般固定根、茎、叶、花药、子房组一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。织切片。幼嫩材料用幼嫩材料用50%酒精代替酒精代替70%酒精，酒精，防止材料收缩；防止材料收缩；加入加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变甘油可防固定液蒸发和材料变硬。硬。卡诺固定液卡诺固定液12纯酒精15ml30ml氯仿5ml 冰醋酸5ml1ml渗透迅速，固定根尖和花药只需渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天但固定时间不能太久，一般不超过一天切片厚度：切片厚度：0.55um切片捞到切片捞到载玻片载玻片上上半薄切片半薄切片半薄切片染色半薄切片染色染色方法染色方法现现象象番红固绿对染法番红固绿对染法木质化的细胞壁及细胞核木质化的细胞壁及细胞核红红纤维素的细胞壁及细胞壁纤维素的细胞壁及细胞壁绿绿铁矾苏木精法铁矾苏木精法细胞一般结构及细胞分裂时期细胞一般结构及细胞分裂时期的优良染剂，细胞分裂时期的的优良染剂，细胞分裂时期的染色体染成染色体染成黑色黑色高碘酸席夫反应法高碘酸席夫反应法（PAS法）法）植物组织染成不同程度的红色，植物组织染成不同程度的红色，可将纤维素细胞壁及淀粉粒染可将纤维素细胞壁及淀粉粒染成成红色红色染料介绍染料介绍细胞壁的染料细胞壁的染料酸性品红酸性品红番红番红固绿固绿甲苯胺蓝甲苯胺蓝苏木精苏木精结晶紫结晶紫亮绿亮绿苏丹苏丹IV细胞核染料细胞核染料（碱性）（碱性）碱性品红碱性品红苏木精苏木精洋红洋红番红番红地地衣红衣红结晶紫结晶紫细胞质染料细胞质染料（酸性）（酸性）酸性品红酸性品红甲苯胺蓝甲苯胺蓝曙红曙红固绿固绿苦味酸苦味酸各种荧光染料各种荧光染料染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染半薄切片：免疫荧光半薄切片：免疫荧光（LRWhite包埋）包埋）半薄切片图片半薄切片图片三、刀具介绍玻璃刀钻石刀钻石刀超薄切片机超薄切片机型号：型号：LEICAULTRACUTR谢谢！