八发酵动力学.pptx

第八章 发酵动力学1 1、定义：、定义：研究发酵过程中的菌体生长、基质消耗、研究发酵过程中的菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。产物生成的动态平衡及其内在规律。2 2、研究内容：、研究内容：1 1）微生物生长过程中的质量与能量平衡；）微生物生长过程中的质量与能量平衡；2 2）发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率）发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率与产物生成速率的关系；与产物生成速率的关系；3 3）环境因素对上述三者的影响。）环境因素对上述三者的影响。3 3、研究目的：最佳工艺条件。、研究目的：最佳工艺条件。第一节第一节 微生物生长代谢过程中微生物生长代谢过程中的质量平衡的质量平衡一、微生物生长代谢过程的碳平衡一、微生物生长代谢过程的碳平衡 1.最低培养基与完全培养基：图8-1和图8-2 最低培养基:由单一碳源葡萄糖与无机盐组成，葡萄糖既是能源，又是构成菌体的材料；完全培养基：由葡萄糖、无机盐等组成，还有酵母浸膏、蛋白胨等。2.2.微生物生长代谢过程中基质和产物之间的碳元素平衡微生物生长代谢过程中基质和产物之间的碳元素平衡 微生物的元素组成：表微生物的元素组成：表8-18-1 这些元素来源于培养基，因此，基质中的碳元素变这些元素来源于培养基，因此，基质中的碳元素变成菌体、产物、二氧化碳中的碳元素。基质中碳元素的成菌体、产物、二氧化碳中的碳元素。基质中碳元素的消耗速度与微生物生长速度、代谢产物的生成速度、二消耗速度与微生物生长速度、代谢产物的生成速度、二氧化碳的生成速度有关。氧化碳的生成速度有关。式中S为基质，X为菌体，P为产物 a1a1为每为每molmol基质中的含碳量，基质中的含碳量，a2a2为每为每g g干菌体内的含碳量，干菌体内的含碳量，a3a3为每为每molmol二氧化碳内的含碳量，二氧化碳内的含碳量，a4a4为每为每molmol产物内的产物内的含碳量。含碳量。3.3.微生物生长过程中的碳源平衡：微生物生长过程中的碳源平衡：在微生物反应中，碳源的用途主要消耗于：在微生物反应中，碳源的用途主要消耗于：满足菌体生长消耗，用满足菌体生长消耗，用 表示；表示；维持微生物生存的消耗，用维持微生物生存的消耗，用 表示；表示；合成代谢产物的消耗，用合成代谢产物的消耗，用 表示。表示。则有：则有：因此，在以菌体为目的的发酵中，发酵因此，在以菌体为目的的发酵中，发酵过程中基质葡萄糖消耗速度与菌体生成量成过程中基质葡萄糖消耗速度与菌体生成量成正比，如图正比，如图8-38-3。4.细胞物质生产中碳源的化学平衡 自然界的一切变化过程都存在着变化前后的质量和能量平衡，发酵过程也不例外。通过研究微生物反应的化学平衡，可帮助我们预测发酵过程中各种基质的需要量，从而更经济、有效地使用它们，减少无效消耗。为减少问题的复杂性，我们在研究发酵过程的化为减少问题的复杂性，我们在研究发酵过程的化学计量式时，可作如下的处理：学计量式时，可作如下的处理：对复杂分子组成的原料用简化的化学式表示对复杂分子组成的原料用简化的化学式表示,如菌体如菌体化学组成表示为化学组成表示为CHCH1.641.64O O0.520.52N N0.160.16 。忽略反应中的一些次要的元素和成分，如忽略反应中的一些次要的元素和成分，如P,CaP,Ca等。等。菌体的生长一般是在供氧条件下，将营养菌体的生长一般是在供氧条件下，将营养基质转化成菌体成分、基质转化成菌体成分、COCO2 2和和H H2 2O O的过程。因此，的过程。因此，如果菌体的化学组成和基质到菌体的最大转化如果菌体的化学组成和基质到菌体的最大转化率已经知道时，就可以列出微生物生长的化学率已经知道时，就可以列出微生物生长的化学计量式。计量式。如青霉菌以葡萄糖为基质，通气培养，其如青霉菌以葡萄糖为基质，通气培养，其菌体化学组成为菌体化学组成为CHCH1.641.64O O0.520.52N N0.160.16、葡萄糖至菌体、葡萄糖至菌体的转化率为的转化率为0.48g0.48g干菌体干菌体/g/g葡萄糖，则可对下葡萄糖，则可对下式进行配平。步骤如下：式进行配平。步骤如下：写出反应化学简式。写出反应化学简式。C C6 6H H1212O O6 6+NH+NH3 3+O+O2 2CHCH1.641.64O O0.520.52N N0.160.16+CO+CO2 2+H+H2 2O O根据转化率配系数。根据转化率配系数。lC C6 6H H1212O O6 6的摩尔质量为的摩尔质量为180180；菌体；菌体CHCH1.641.64O O0.520.52N N0.160.16摩尔质摩尔质量为量为24.224.2（12+1.64+160.52+140.1612+1.64+160.52+140.16）l已知葡萄糖至菌体的转化率为已知葡萄糖至菌体的转化率为0.48g0.48g干菌体干菌体/g/g葡萄糖，葡萄糖，则以则以1 1摩尔葡萄糖为基准，生成菌体的量为摩尔葡萄糖为基准，生成菌体的量为1800.48=86.4g1800.48=86.4g，那么，菌体的摩尔数为：，那么，菌体的摩尔数为：86.424.2=3.5786.424.2=3.57通过质量平衡，配平其他成分的系数，最后得到的通过质量平衡，配平其他成分的系数，最后得到的计量方程式。计量方程式。C C6 6H H1212O O6 6+0.57NH+0.57NH3 3+2.33O+2.33O2 2 3.57CH3.57CH1.641.64O O0.520.52N N0.160.16+2.43CO+2.43CO2 2+3.93H+3.93H2 2O Ol5.5.对微生物生长过程进行碳平衡的意义对微生物生长过程进行碳平衡的意义l1 1）碳源的利用情况和碳源的转化率是）碳源的利用情况和碳源的转化率是一项重要的经济指标；一项重要的经济指标；l2 2）碳平衡的方程式是发酵过程基质消）碳平衡的方程式是发酵过程基质消耗的重要计量方程；耗的重要计量方程；l3 3）对于以菌体为目的的发酵，碳平衡）对于以菌体为目的的发酵，碳平衡方程可计算出微生物菌体的生成速度。方程可计算出微生物菌体的生成速度。二、二、微生物生长代谢过程中的微生物生长代谢过程中的ATPATP循环与氧平衡循环与氧平衡 1.ATP1.ATP循环循环 微生物生长代谢过程中的微生物生长代谢过程中的ATPATP循环示意图循环示意图：合成代谢合成代谢 ATP ATP 分解代谢分解代谢 ADPADP 维持代谢维持代谢 2.2.生物氧化生物氧化 1mol1mol葡萄糖彻底氧化生成葡萄糖彻底氧化生成38molATP38molATP 3.3.微生物代谢过程中的氧平衡微生物代谢过程中的氧平衡 假定发酵是在充分供氧的条件下进假定发酵是在充分供氧的条件下进行，即所消耗的基质除一部分被同化到行，即所消耗的基质除一部分被同化到菌体和产物外，其余全部被氧化生成菌体和产物外，其余全部被氧化生成COCO2 2和和H H2 2O O，则由能量守恒定律可得氧元素的，则由能量守恒定律可得氧元素的平衡式：平衡式：微生物代谢过程中基质完全氧化的耗微生物代谢过程中基质完全氧化的耗氧量氧量S S，包括菌体、代谢产物完全氧化，包括菌体、代谢产物完全氧化耗氧量耗氧量X X、P P，和微生物生长过程中，和微生物生长过程中的耗氧量的耗氧量O O2 2三部分，三部分，A A，B B，C C是系数。是系数。4.ATP4.ATP消耗对菌体得率消耗对菌体得率Y YATPATP与与ATPATP平衡平衡 能量通过高能磷酸键贮存、转运。在供氧充分时，三羧酸循环中间代谢产物被脱氢酶脱下两个质子氢，分别经由质子递体和电子递体传递到氧，以氧作为最终电子受体，生成水，同时释放能量，该能量被高能键贮存；在嫌气条件下，只能进行基质水平的磷酸化，此时，有机物氧化不彻底，所以产生的能量也较低。能量生长偶联型与能量生长非偶联型：当构成菌体的材料充裕时，菌体的生长受制于ATP的供应，这种生长就是能量偶联型生长；反之，在ATP供应充分，而合成细胞的材料受限制时，这时的生长就是能量生长非偶联型，即与ATP供应无关，此时，大量的ATP在ATP酶的作用下被降解，以热能的形式释放出大量的热量形成发酵热异常升高。涉及到能量供应的菌体得率用 表示，即每消耗1mol ATP所生成菌体的质量：对能量偶联型生长，大约在对能量偶联型生长，大约在1010左右；非能量左右；非能量偶联型生长，大大低于偶联型生长，大大低于1010，如表，如表8-28-2。有氧气存在时，有氧气存在时，Y YATPATP的测定比较困难，的测定比较困难，原因是：原因是：有些供能基质被用于合成代谢；有些供能基质被用于合成代谢；培养基内被认为不是供能基质的却有一些被培养基内被认为不是供能基质的却有一些被用来产生能量；用来产生能量；至今对于具体的每种微生物，其氧化作用与至今对于具体的每种微生物，其氧化作用与磷酸化作用偶联的程度与控制机制尚不清楚；磷酸化作用偶联的程度与控制机制尚不清楚；各种微生物用于维持其生命活动所需的能量各种微生物用于维持其生命活动所需的能量也不相同。也不相同。l5.5.通风培养时氧的消耗与通风培养时氧的消耗与ATPATP生成生成数量之间关系：数量之间关系：l在通风培养时，氧的消耗与基质氧在通风培养时，氧的消耗与基质氧化生成化生成ATPATP的数量之间有一定的关系，的数量之间有一定的关系用用P/O(mol/g)P/O(mol/g)表示。表示。l酵母菌酵母菌P/O=1P/O=1左右，一般微生物左右，一般微生物P/O=0.5-1P/O=0.5-1，哺乳动物肝脏细胞，哺乳动物肝脏细胞P/O=3P/O=3lP/OP/O是一个特征常数。是一个特征常数。第二节第二节 微生物发酵动力学微生物发酵动力学生物反应器的操作方式包括分批培养、连续培养生物反应器的操作方式包括分批培养、连续培养和补料分批培养三种。和补料分批培养三种。一、分批培养一、分批培养l是目前微生物培养的最基本的方式，即在一个密闭系是目前微生物培养的最基本的方式，即在一个密闭系统内一次性投入有限数量的营养物进行培养的方法，统内一次性投入有限数量的营养物进行培养的方法，包括设备灭菌、种子培养、发酵操作几个单元步骤。包括设备灭菌、种子培养、发酵操作几个单元步骤。l优点：优点：l（1 1）每一次进行重复的配料、灭菌等操作，微生物培）每一次进行重复的配料、灭菌等操作，微生物培养可靠、安全。养可靠、安全。l（2 2）微生物发酵过程中，微生物的各个阶段的生理、）微生物发酵过程中，微生物的各个阶段的生理、代谢特征不同，易于控制。代谢特征不同，易于控制。l缺点：缺点：l1 1）效率较低，每次发酵重复进行，既是一种）效率较低，每次发酵重复进行，既是一种时间的浪费，又是原材料和能量和浪费。时间的浪费，又是原材料和能量和浪费。l2 2）底物利用率低，分次分批发酵都存在一个）底物利用率低，分次分批发酵都存在一个微生物自身的增殖过程，增殖本身就是底物微生物自身的增殖过程，增殖本身就是底物消耗的过程，这必然导致转化率的降低，例消耗的过程，这必然导致转化率的降低，例如，在如，在GAGA的发酵过程中，微生物增殖所需要的发酵过程中，微生物增殖所需要的的C C源占总源占总C C源的源的20%20%左右。左右。l3 3）分批发酵培养基中的底物浓度较高，增加）分批发酵培养基中的底物浓度较高，增加了培养基的渗透压，不利于微生物的生长。了培养基的渗透压，不利于微生物的生长。（一）微生物的生长曲线将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌定时取样，测菌量。以培养时间量。以培养时间为横坐标，以细为横坐标，以细菌增长数目的对菌增长数目的对数为纵坐标，绘数为纵坐标，绘制曲线。制曲线。l1.迟滞期l现象：活菌数没增加。现象：活菌数没增加。l原因：由于细胞进入新环境原因：由于细胞进入新环境,有一个适应过程，进行有一个适应过程，进行大量的酶（诱导酶）的合成。大量的酶（诱导酶）的合成。l细胞特点细胞特点:细胞的新陈代谢非常旺盛，个体体积显著细胞的新陈代谢非常旺盛，个体体积显著增大，为细胞分裂作准备。增大，为细胞分裂作准备。l此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培养条此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培养条件有关。件有关。l意义：在实际工作中，缩短意义：在实际工作中，缩短lag phase lag phase 的措施：的措施：l1 1）加大接种量（群体优势）加大接种量（群体优势-适应性增强）；适应性增强）；l2 2）先用对数期的种子（此时细胞分裂旺盛）；）先用对数期的种子（此时细胞分裂旺盛）；l3 3）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分；成分；l4 4）选用繁殖快的菌种。）选用繁殖快的菌种。2.对数期现象：细胞数目以现象：细胞数目以几何级数增加，其几何级数增加，其对数与时间呈直线对数与时间呈直线关系。关系。l细胞特点：细胞特点：l1 1、细胞保持均恒生长；、细胞保持均恒生长；l2 2、不不断断吸吸收收培培养养基基中中的的营营养养成成分分以以合合成成自自身物质，并不断向培养基中分泌代谢产物；身物质，并不断向培养基中分泌代谢产物；l3 3、由由于于此此时时培培养养基基中中的的营营养养成成分分远远远远过过量量，且且积积累累的的代代谢谢产产物物尚尚不不足足以以抑抑制制微微生生物物本本身身的的生生长长繁繁殖殖，因因而而微微生生物物的的生生长长速速率率不不受受这这些些因因素素的的影影响响，而而仅仅与与微微生生物物本本身身的的比比生生长长速率速率及发酵液中的生物量浓度及发酵液中的生物量浓度S(g/L)S(g/L)相关。相关。N N培养基中的细胞密度培养基中的细胞密度-比生长速率比生长速率对于特定的微生物而言，其比生长速率对于特定的微生物而言，其比生长速率只与三只与三个因素有关，即限制性营养物质的浓度、最大比个因素有关，即限制性营养物质的浓度、最大比生长速率生长速率mm、底物相关常数、底物相关常数KsKs。假定营养物质进入细胞后，立即被利用而不积累，假定营养物质进入细胞后，立即被利用而不积累，则存在以下关系式：则存在以下关系式：l意义：意义：l为为保保证证工工业业发发酵酵的的正正常常周周期期，要要尽尽可可能能地使微生物的比生长速率接近其最大值。地使微生物的比生长速率接近其最大值。l最最大大比比生生长长速速率率不不仅仅与与微微生生物物本本身身的的性性质质有有关关，也也与与所所消消耗耗的的底底物物以以及及培培养养的的方式有关。方式有关。l限限制制微微生生物物生生长长代代谢谢的的并并不不是是发发酵酵液液中中营营养养物物质质的的浓浓度度，而而是是营营养养物物质质进进入入细细胞的速度。胞的速度。3.稳定期现象：现象：活菌数目不增不减，生长速率趋于活菌数目不增不减，生长速率趋于0,0,曲线有曲线有一下降的趋势。一下降的趋势。特点：特点：细胞的菌体形态典型，芽孢形成，细胞内开细胞的菌体形态典型，芽孢形成，细胞内开始贮藏物质。出现原因营养物质大量消耗；有毒代谢始贮藏物质。出现原因营养物质大量消耗；有毒代谢产物大量积累；外界条件影响（产物大量积累；外界条件影响（pHpH、高细胞浓度，氧、高细胞浓度，氧化还原电位等）化还原电位等）意义：意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：措施如下：补充营养物质（补料）；调补充营养物质（补料）；调pHpH；调整温度；调整温度稳定期细胞数目及产物积累达到最高。稳定期细胞数目及产物积累达到最高。4.衰亡期l现象：细胞死亡速率现象：细胞死亡速率生长速率。一般总生长速率。一般总菌数不变菌数不变,活菌数下降。活菌数下降。l特点：菌体变形，大小不一，细胞出现特点：菌体变形，大小不一，细胞出现自溶自溶,生理代谢活动停滞。生理代谢活动停滞。（二）微生物生长速度的动力学方程 1）细胞生长动力学 在一个间歇培养的周期中，菌体数量的在一个间歇培养的周期中，菌体数量的增加主要是在对数生长期实现的，因此讨论增加主要是在对数生长期实现的，因此讨论微生物生长动力学时，是以生长曲线的对数微生物生长动力学时，是以生长曲线的对数生长期为目标建立其生长模型。生长期为目标建立其生长模型。微生物的生长速度：微生物的生长速度：l f(s,Of(s,O2 2,T,pH,T,pH,),)l 在一定条件下在一定条件下(基质限制基质限制)：l f(S)f(S)l2 2）微生物生长速率与底物浓度的关系）微生物生长速率与底物浓度的关系莫诺模型莫诺模型 基质浓度与生长速度的关系基质浓度与生长速度的关系 米氏方程米氏方程单一限制性基质：就单一限制性基质：就是指在培养微生物的是指在培养微生物的营养物中，对微生物营养物中，对微生物的生长起到限制作用的生长起到限制作用的营养物。的营养物。：菌体的生长比速：菌体的生长比速S S：限制性基质浓度：限制性基质浓度KsKs：半饱和常数，也叫底物利：半饱和常数，也叫底物利用常数，其数值相当于用常数，其数值相当于正处正处于于 maxmax一半时的底物浓度，是一半时的底物浓度，是反映微生物对该底物的亲和力反映微生物对该底物的亲和力（K KS S越大，亲和力越低）。越大，亲和力越低）。max:max:最大比生长速度最大比生长速度lMonodMonod方程的参数求解方程的参数求解(双倒数法双倒数法)：l将将MonodMonod方程取倒数可得：方程取倒数可得：l 或或 l这样通过测定不同限制性基质浓度下微生物的这样通过测定不同限制性基质浓度下微生物的l比生长速度，就可以通过回归分析计算出比生长速度，就可以通过回归分析计算出lMonodMonod方程的两个参数。方程的两个参数。莫诺方程是在如下的假设基础上建立起来的：莫诺方程是在如下的假设基础上建立起来的：菌体生长为均衡型非结构式生长（只有数量的增长）菌体生长为均衡型非结构式生长（只有数量的增长），因此，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表，因此，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示即可；示即可；培养基中只有一种底物是生长限制性底物，其他营培养基中只有一种底物是生长限制性底物，其他营养成分不影响微生物生长；养成分不影响微生物生长；将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。数，没有动态滞后。莫诺方程与米氏方程形式相同，但微生物生长莫诺方程与米氏方程形式相同，但微生物生长是细胞群体生命活动的综合表现，机理非常复杂。是细胞群体生命活动的综合表现，机理非常复杂。莫诺方程中的常数和可用数理统计方法，通过莫诺方程中的常数和可用数理统计方法，通过实验求得，也可以用实验数据作图求得。实验求得，也可以用实验数据作图求得。分批发酵：某生物技术有限公司的生产车间（120M3）饲料金霉素发酵二、补料分批培养二、补料分批培养 所谓分批补料培养技术，就是指在分批所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养开始，投入较低浓度的底物，然后在发培养开始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。即，容积产量、产物浓度和产物得率的目的。即，补料分批发酵又称半连续发酵或半连续培养，补料分批发酵又称半连续发酵或半连续培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基。新鲜培养基。补补料料分分批批培培养养l分批补料培养特点：分批补料培养特点：l1)1)分批补料培养技术是介于分批培养相连续培分批补料培养技术是介于分批培养相连续培养之间的一种发酵技术。养之间的一种发酵技术。l2)2)由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。分批补料系统不再是一个封闭的系统。l3)3)分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。随时间和物料流速而变化的变量。l补料发酵的优点：补料发酵的优点：l补料发酵可以使发酵系统中维持很低的基质浓度，补料发酵可以使发酵系统中维持很低的基质浓度，其优点在于：其优点在于：l1)1)可以消除快速利用碳源的阻遏效应可以消除快速利用碳源的阻遏效应(末端产物阻末端产物阻遏、分解代谢产物阻遏遏、分解代谢产物阻遏)；并维持适当的菌体浓度，；并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾；使不致于加剧供氧的矛盾；l2)2)避免培养基积累有毒代谢物；避免培养基积累有毒代谢物；l3)3)与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题；菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题；l适用范围：补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基适用范围：补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。三、连续培养三、连续培养 概念：当微生物菌体达到某一特定状态时，（这一状态可以是：菌体浓度、比生长速率、产物的比生成速率等），连续向反应器内流加混合底物（C、N、P），同时反应器排放等量的发酵液。优点：微生物处于一个稳定的底物浓度和产物浓度的环境中，从理论上讲，这种方式是最高效率的微生物培养方式。节省消耗（底物、能量）l连续培养缺点：连续培养缺点：l1)1)特别是以中间代谢产物为发酵产品的发酵，特别是以中间代谢产物为发酵产品的发酵，在理论和实践上都没有完全解决，如发酵过程中在理论和实践上都没有完全解决，如发酵过程中微生物生理生化特性变化，发酵动力学等并未充微生物生理生化特性变化，发酵动力学等并未充分了解。分了解。l2)2)在生产上要保持在连续发酵的整个过程中，在生产上要保持在连续发酵的整个过程中，生产菌株易于退化。生产菌株易于退化。l3)3)长时间的连续发酵中对发酵设备和空气净化长时间的连续发酵中对发酵设备和空气净化系统的无菌要求更高。不能保持长时间的无菌操系统的无菌要求更高。不能保持长时间的无菌操作是导致连续发酵失败的主要原因。作是导致连续发酵失败的主要原因。l4)4)对于某些原材料价格昂贵的产品，由对于某些原材料价格昂贵的产品，由于连续发酵对基质利用率较低，往往造于连续发酵对基质利用率较低，往往造成生产成本的增加。在连续培养中，营成生产成本的增加。在连续培养中，营养物的利用率一般亦低于单批培养。养物的利用率一般亦低于单批培养。连续培养营养物料平衡：连续培养营养物料平衡：流入流入 流出流出 生长消耗生长消耗 维持生维持生命需要命需要 形成产物的消耗形成产物的消耗 =积累的营积累的营养物养物l连续培养的应用范围l1)在酿造业中应用；l2)在菌体生产中应用；l3)应用于菌体分离和改良；l4)考查应用于分批或分批补料培养的工业生产菌株的一些基本特性。l连续培养在工业生产上的应用还很有限的原因连续培养在工业生产上的应用还很有限的原因l1)1)许多方法只能连续运转许多方法只能连续运转2020一一200200小时，而工小时，而工业系统则要求必须能稳定运行业系统则要求必须能稳定运行500500一一10001000小时小时以上；以上；l2)2)工业生产规模长时间保持无菌状态有一定工业生产规模长时间保持无菌状态有一定困难；困难；l3)3)连续培养所用培养基的组成要保持相对稳连续培养所用培养基的组成要保持相对稳定，这样才能取得最大产量，而工业培养基的定，这样才能取得最大产量，而工业培养基的组成成分，如玉米浆、蛋白胨和淀粉等，在批组成成分，如玉米浆、蛋白胨和淀粉等，在批与批之间有时会出现较大变化；与批之间有时会出现较大变化；l4)4)当使用高产菌株进行生产时，回复突变可当使用高产菌株进行生产时，回复突变可能发生。在连续培养过程中，回复突变的菌株能发生。在连续培养过程中，回复突变的菌株有可能会取代生产菌株而成为优势菌株。有可能会取代生产菌株而成为优势菌株。（一）连续培养设备的类型：（一）连续培养设备的类型：1.1.均匀混合的生物反应器均匀混合的生物反应器1 1）恒浊器和恒浊培养：）恒浊器和恒浊培养：在恒浊器内，调节培在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。连续培养方法。l原理：维持菌浓度不变。原理：维持菌浓度不变。l特点：基质过量，菌以特点：基质过量，菌以l最高速率生长；但工艺最高速率生长；但工艺l复杂，烦琐。复杂，烦琐。l2 2）恒化器和恒化培养：）恒化器和恒化培养：l 以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。菌生长速率恒定的方法。l原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。l特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率。长速率。l一般来说，恒浊器较难控制，目前大多数研究一般来说，恒浊器较难控制，目前大多数研究工作者都利用恒化器进行连续培养的研究。工作者都利用恒化器进行连续培养的研究。2.2.活塞流反应器活塞流反应器l这是一种不均一的管状反应器，培养基由反应器的一这是一种不均一的管状反应器，培养基由反应器的一端流入，而从另一端流出。端流入，而从另一端流出。l在这种反应器中，没有返混现象，因而，反应器内的在这种反应器中，没有返混现象，因而，反应器内的培养基呈极化状态，在其不同的部位，营养物的成分、培养基呈极化状态，在其不同的部位，营养物的成分、细胞数目、传质效果、氧供应和生产量都不相同。对细胞数目、传质效果、氧供应和生产量都不相同。对于这类反应器，在其入口处，加入物料的同时也必须于这类反应器，在其入口处，加入物料的同时也必须加入微生物细胞。通常是在反应器的出口处装一支路，加入微生物细胞。通常是在反应器的出口处装一支路，使细胞返回，也可以来自另一连续培养装置使细胞返回，也可以来自另一连续培养装置(种子供种子供应系统应系统)。l另外，这种反应器常用于固定化菌和固定化细胞所催另外，这种反应器常用于固定化菌和固定化细胞所催化的反应，这时就无需再在进料口处加入催化剂。化的反应，这时就无需再在进料口处加入催化剂。l（二）连续发酵的类型：（二）连续发酵的类型：l1、开放式连续发酵系统：单罐均匀混 合连续发酵、多罐均匀混合连续发酵、管道非均匀混合连续发酵、塔式非均匀混合连续发酵l2、封闭式连续发酵系统：类类 型型开放式开放式(菌体取出菌体取出)封闭式封闭式(菌体不取出菌体不取出)单罐单罐多罐多罐单罐单罐多罐多罐均均匀匀混混合合非非循循环环搅搅拌拌发发酵酵罐罐搅拌罐搅拌罐(串联串联)透析膜培养透析膜培养循循环环搅搅拌拌发发酵酵罐罐(菌菌体体部部分分重重复复使使用用)搅搅拌拌罐罐串串联联(菌菌体体部部分分重重复复使使用用)搅搅拌拌发发酵酵罐罐(菌菌体体100100重重复使用复使用)搅搅拌拌发发酵酵罐罐串串 联联(菌菌 体体100100 重重 复复使用使用)非非均均匀匀混混合合非非循循环环管管道道发发酵酵器器塔塔式式发发酵罐酵罐塔塔式式发发酵酵罐罐装装有有隔隔板板的的管管道道发发酵酵器器(卧卧式式、立式立式)塔塔式式发发酵酵罐罐(菌菌体体100100重重复使用复使用)塔塔式式发发酵酵罐罐(菌菌体体100100重复使用重复使用)循循环环管管道道发发酵酵器器塔塔式式发发酵酵罐罐(菌菌体体部部分分重重复复使用使用)塔塔式式发发酵酵罐罐装装有有隔隔板板的的管管道道发发酵酵器器(菌菌体体部部分重复使用分重复使用)管管道道发发酵酵器器(菌菌体体100100重重复使用复使用)塔塔式式发发酵酵罐罐装装有有隔隔板板的的管管 道道(菌菌 体体100100 重重 复复使用使用)l1 1开放式连续发酵开放式连续发酵l在开放式连续发酵系统中，培养系统中在开放式连续发酵系统中，培养系统中的微生物细胞随着发酵液的流出而一起的微生物细胞随着发酵液的流出而一起流出，细胞流出速度等于新细胞形成速流出，细胞流出速度等于新细胞形成速度。因此在这种情况下，可使细胞浓度度。因此在这种情况下，可使细胞浓度处于某种稳定状态。处于某种稳定状态。l另另外外，最最后后流流出出的的发发酵酵液液如如部部分分返返回回(反反馈馈)发发酵酵罐罐进进行行重重复复使使用用，则则该该装装置置叫叫做做循循环环系系统统，发发酵酵液液不不重重复复使使用用的的装装置置叫叫做不循环系统。做不循环系统。l(1)(1)单罐均匀混合连续发酵：培养液以一单罐均匀混合连续发酵：培养液以一定的流速不断地流加到带机械搅拌的发定的流速不断地流加到带机械搅拌的发酵罐中，与罐内发酵液充分混合，同时酵罐中，与罐内发酵液充分混合，同时带有细胞和产物的发酵液又以同样流速带有细胞和产物的发酵液又以同样流速连续流出。如果用一个装置将流出的发连续流出。如果用一个装置将流出的发酵液中部分细胞返回发酵罐，就构成循酵液中部分细胞返回发酵罐，就构成循环系统。环系统。l(2)(2)多罐均匀混合连续发酵：将若干搅拌多罐均匀混合连续发酵：将若干搅拌发酵罐串联起来，就构成多罐均匀混合发酵罐串联起来，就构成多罐均匀混合连续发酵装置。新鲜培养液不断流人第连续发酵装置。新鲜培养液不断流人第一只发酵罐，发酵液以同样流速依次流一只发酵罐，发酵液以同样流速依次流人下一只发酵罐，在最后一只罐中流出。人下一只发酵罐，在最后一只罐中流出。多级连续发酵可以在每个罐中控制不同多级连续发酵可以在每个罐中控制不同的环境条件以满足微生物生长各阶段的的环境条件以满足微生物生长各阶段的不同需要，并能使培养液中的营养成分不同需要，并能使培养液中的营养成分得到较充分的利用，最后流出的发酵液得到较充分的利用，最后流出的发酵液中细胞和产物的浓度较高，所以是最经中细胞和产物的浓度较高，所以是最经济的连续方法。济的连续方法。l(3)(3)管管道道非非均均匀匀混混合合连连续续发发酵酵：管管道道的的形形式式有有多多种种，如如直直线线形形、S S形形、蛇蛇形形管管等等。培培养养液液和和从从种种子子罐罐来来的的种种子子不不断断流流入入管管道发酵器内，使微生物在其中生长。道发酵器内，使微生物在其中生长。l这这种种连连续续发发酵酵的的方方法法主主要要用用于于厌厌氧氧发发酵酵。如如在在管管道道中中用用隔隔板板加加以以分分隔隔，每每一一个个分分隔隔等等于于一一台台发发酵酵罐罐，就就相相当当于于多多罐罐串串联联的连续发酵。的连续发酵。l(4)(4)塔式非均匀混合连续发酵：塔式非均匀混合连续发酵：塔塔式式发发酵酵罐罐有有两两种种：一一种种是是用用多多孔孔板板将将其其分分隔隔成成若若干干室室，每每个个室室等等于于一一台台发发酵酵罐罐，这这样样一一台台多多孔孔板板塔塔式式发发酵酵罐罐就就相相当当于一组多级串联的连续发酵装置。于一组多级串联的连续发酵装置。另另一一种种是是在在罐罐内内装装设设填填充充物物，使使菌菌体体在在上面生长，这种形式仍然属于单罐式。上面生长，这种形式仍然属于单罐式。l2 2封闭式连续发酵封闭式连续发酵l在在封封闭闭式式连连续续发发酵酵系系统统中中，运运用用某某种种方方法法使使细细胞胞一一直直保保持持在在培培养养器器内内，并并使使其其数数量量不不断断增增加加。这这种种条条件件下下，某某些些限限制制因因素素在在培培养养器器中中发发生生变变化化，最最后后大大部部分分细细胞胞死死亡亡。因因此此在在这这种种系系统统中中，不可能维持稳定状态。不可能维持稳定状态。l封封闭闭式式连连续续发发酵酵可可以以用用开开放放式式连连续续发发酵酵设设备备加加以改装，只要使全部菌体重新循环使用。以改装，只要使全部菌体重新循环使用。l另另一一种种方方法法是是采采用用间间隔隔物物或或填填充充物物置置于于设设备备内内，使使菌菌体体在在上上面面生生长长，发发酵酵液液流流出出时时不不带带细细胞胞或或所带细胞极少。所带细胞极少。l透透析析膜膜连连续续发发酵酵是是一一个个新新方方法法，它它是是采采用用一一种种具具有有微微孔孔的的有有机机膜膜将将发发酵酵设设备备分分隔隔，这这种种膜膜只只能通过发酵产物，而不能通过菌体细胞。能通过发酵产物，而不能通过菌体细胞。l将将培培养养液液连连续续流流加加到到发发酵酵设设备备的的具具有有菌菌体体的的间间隔隔中中，微微生生物物的的代代谢谢产产物物就就通通过过透透析析膜膜连连续续不不断地从另一间隔流出。断地从另一间隔流出。l在在一一些些发发酵酵过过程程中中，当当发发酵酵液液中中代代谢谢产产物物积积累累到到一一定定程程度度时时就就会会抑抑制制它它的的继继续续积积累累，而而采采用用透透析析膜膜发发酵酵的的方方法法可可使使代代谢谢产产物物不不断断透透析析出出去去，发酵液中留下不多，因而可以提高产品得率。发酵液中留下不多，因而可以提高产品得率。第八章思考题l1.1.名词解释名词解释:l发酵动力学发酵动力学;最低培养基最低培养基;完全培养基完全培养基;能量生长偶联能量生长偶联型型;能量生长非偶联型能量生长非偶联型;分批培养分批培养;连续培养连续培养;补料分补料分批培养批培养;恒浊培养恒浊培养;恒化培养恒化培养;l22.问答题问答题:l1)1)某菌以葡萄糖为基质，通气培养，其菌体化学组某菌以葡萄糖为基质，通气培养，其菌体化学组成为成为CHCH1.521.52O O0.610.61、葡萄糖至菌体的转化率为、葡萄糖至菌体的转化率为0.53g0.53g干菌干菌体体/g/g葡萄糖葡萄糖,试列出微生物生长的化学计量式。试列出微生物生长的化学计量式。l2)2)简述研究微生物生长过程中碳平衡的意义简述研究微生物生长过程中碳平衡的意义.l3)3)简述分批培养的优缺点简述分批培养的优缺点.l4)4)写出微生物生长速率与底物浓度的关系莫诺模型写出微生物生长速率与底物浓度的关系莫诺模型,并解释之并解释之.l5)5)简述分批补料培养的特点简述分批补料培养的特点.l6)6)简述连续培养的优缺点简述连续培养的优缺点.