免疫比浊法检测免疫球蛋白.pptx

免疫比浊法检测免疫球蛋白免疫学系免疫学系 实验原理实验原理免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后测定这种折射或吸收后的透射光或散射光的透射光或散射光作为计算单位。作为计算单位。免免疫疫比比浊浊法法分分类类当一束光当一束光线通过溶线通过溶液受到光液受到光散射和光散射和光吸收两个吸收两个因素的影因素的影响而使光响而使光的强度减的强度减弱弱透射比浊法透射比浊法透射比浊法透射比浊法:在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（0 0 0 00 0 0 0）测量透射光强度和被检测测量透射光强度和被检测测量透射光强度和被检测测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。溶液微粒浓度关系的方法。溶液微粒浓度关系的方法。溶液微粒浓度关系的方法。散射比浊法散射比浊法散射比浊法散射比浊法:在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（5 5 5 50-0-0-0-969696960 0 0 0）角的方向上测量透射光强度角的方向上测量透射光强度角的方向上测量透射光强度角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关和被检测溶液中微粒浓度关和被检测溶液中微粒浓度关和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。系的方法。系的方法。系的方法。透射比浊法和散射比浊法光路透射比浊法和散射比浊法光路检测器检测器A检测器检测器BICI0II 透射比浊法透射比浊法 散射比浊法散射比浊法（一）（一）基本原理基本原理v 是个极其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测是个极其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测样品中相应的样品中相应的IgIg发生抗原发生抗原-抗体反应，形成可溶性复合抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介质的浊度发生改变。物，使反应介质的浊度发生改变。v 测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单位（吸收单位（A A）或）或ODOD值表示，值表示，A A值反映了入射光和透射光值反映了入射光和透射光的比率。待测物中的比率。待测物中IgIg含量可通过标准曲线计算得出。含量可通过标准曲线计算得出。v 待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。光呈反比。v 反应在反应在PEGPEG的作用下，加速复合物的形成。的作用下，加速复合物的形成。免疫透射比浊法免疫透射比浊法透射比浊法测定原理光光源源诱诱导导剂剂样品光电计滤光片光源透射比浊法测定原理透射比浊法的缺陷：(1)溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大，分子太小则阻挡不了光线的通过。(2)溶液中的抗原抗体复合物的数量要足够多。如果数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。(3)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原抗体温育反应时间，检测时间较长。光通量是每单位时间到达、离开或通过曲面光通量是每单位时间到达、离开或通过曲面的的光能数量光能数量 原理原理散射比浊法散射比浊法在入射光的在入射光的一定角度一定角度检测粒子发出的散检测粒子发出的散射光，射光，散射光的强度与散射光的强度与ICIC的含量呈正比的含量呈正比。散射比浊法测定原理增增增增加加加加散散散散透透透透率率率率:660nm:660nm测测测测定定定定散散散散射射射射光光光光聚集聚集形成形成诱导剂诱导剂散射光测定散射光测定检测器(LED)光电计样品100%0%时间散射光强度 速率散射比浊法速率散射比浊法 （一）（一）基本原理基本原理 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，是在所谓速率，是在单位时间内单位时间内抗原抗体结合形成抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。的速率比浊分析。当仪器测定到某一时当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时，间内形成速率下降时，即出现即出现速率峰速率峰，该峰，该峰 值的高低，即代表所值的高低，即代表所 测抗原的量。测抗原的量。CONCENTRATIONRATE在速率峰基础上完成的标准曲线在速率峰基础上完成的标准曲线方法评价：方法评价：敏感度高敏感度高 快速快速(不必达平衡）不必达平衡）抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不受本底散射信号的影响受本底散射信号的影响 可检测微量样品可检测微量样品 原理原理2.2.终点散射比浊法终点散射比浊法让抗原抗体作用一定时间，使其反应让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡达到平衡后，后，测定其测定其ICIC形成的量。形成的量。ICIC的浊度不再受时间的影响的浊度不再受时间的影响，但，但反应反应ICIC聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。散射比浊法散射比浊法的缺陷的缺陷(1)(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测样本的吸收和散射效果，可测定结果不准待测样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确确(2)(2)测定的仍是抗原抗体反应的第二阶段，不适测定的仍是抗原抗体反应的第二阶段，不适合快速检测。合快速检测。(3)(3)终点法存在反应本底终点法存在反应本底，测定样本的含量越低，测定样本的含量越低本底比例越大，故在微量测定时，本底的干扰本底比例越大，故在微量测定时，本底的干扰是影响准确测定的重要因素。是影响准确测定的重要因素。影响免疫比浊测定的因素1 1、抗原抗体比例、抗原抗体比例2 2、抗体的质量、抗体的质量 抗体的特异性、效价、亲和力抗体的特异性、效价、亲和力3 3、反应的溶液、反应的溶液4 4、增浊剂的使用、增浊剂的使用1 1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。检测的周期较长。2 2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。透射比浊法和散射比浊法优缺点比较透射比浊法和散射比浊法优缺点比较免疫浊度法测定中应注意的问题免疫浊度法测定中应注意的问题1 1、伪浊度的影响、伪浊度的影响 伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。2 2、非特异性散射光的影响、非特异性散射光的影响 免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗体组分在体组分在3 3以下，散射比浊法需保证在以下，散射比浊法需保证在 0.50.5以下。以下。本实验中应用聚乙二醇的生理特性本实验中应用聚乙二醇的生理特性 聚乙二醇是聚乙二醇是中性、无毒中性、无毒且具有独特理化性质和良好的且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即聚乙二醇即PEGPEG具有高度具有高度的亲水性的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，可。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。材料材料1.1.免疫球蛋白试剂免疫球蛋白试剂A,M,GA,M,G2.2.免疫球蛋白试剂免疫球蛋白试剂A,M,GA,M,G校准品，蒸馏水校准品，蒸馏水3.3.微量加样枪微量加样枪4.4.分光光度仪分光光度仪 结果计算方法结果计算方法Ig浓度（g/L）=Ig校准浓度（g/L）样本管吸光度校准管浓度