免疫共沉淀.pptx

免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术一.免疫沉淀（IP）二.免疫共沉淀（CO-IP）三.免疫共沉淀结果分析 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（IPIPIPIP）定义定义一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（IPIPIPIP）原理原理 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC 片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G 预先结合在argarose beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的prorein A/G 就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（IPIPIPIP）原理原理一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（IPIPIPIP）步骤步骤 抗体与细胞裂解液或上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G），通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白，再进行SDS-PAGE，Western blotting 或质谱分析，即样品处理（温度，裂解样品处理（温度，裂解液成分）；抗体液成分）；抗体-agarose beads-agarose beads孵育（选择合适的阴性对照）；孵育（选择合适的阴性对照）；抗体抗体-agarose beads-agarose beads复合物洗涤；鉴定复合物洗涤；鉴定一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（IPIPIPIP）要求要求非变性条件下进行实验；需要高质量的抗体免疫沉淀体系需要有严格的控制指标基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段：免疫共沉淀；染色质免疫沉淀；RNA-蛋白免疫沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）定义定义 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质蛋白质x x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质蛋白质y y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）原理原理二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）原理原理（1）蛋白样品准备：如果为细胞样品，需先裂解细胞；（2）抗原抗体结合反应；（3）Protein A/G 与抗原抗体复合物结合；（4）免疫复合物与 protein A/G 解离：一般采用 2%SDS 煮沸 5 分钟处理样品；（5）分析鉴定：应用 SDS-PAGE，western-blotting 或质谱仪分析鉴定样品二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）实验流程实验流程蛋白A，蛋白B 抗A抗体C进行洗脱抗B抗体D进行验证？二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）与与IPIP比较比较IP C AIP C ACO-IP C A+B DCO-IP C A+B D相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）优点优点可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，实验本身具有冒险性。二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）缺点缺点1.实验最需要注意点就是抗体的性质抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。2.为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑蛋白酶抑制剂制剂，低温低温下进行实验。3.考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（二、免疫共沉淀（CO-IPCO-IPCO-IPCO-IP）注意注意在免疫共沉淀实验中保证实验结果的真实性？(1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(2)要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(3)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。三、免疫共沉淀结果分析三、免疫共沉淀结果分析IRF-3与TRAM有互作；TRAM与IRF-3有互作；CBP与TRAM有互作。三、免疫共沉淀结果分析三、免疫共沉淀结果分析INMAP是一个在有丝分裂中起重要作用的蛋白，保证了纺锤体和端粒的完整性。本 文 研 究 了INMAP通过P53/P21途 径 起作用。三、免疫共沉淀结果分析三、免疫共沉淀结果分析结论？