凝胶层析法分离酪蛋白与核黄素.pptx

2.Gel Chromatography Separate Casein and Riboflavin by Sephadex G-75 Purpose basic operation of gel chromatography(凝胶层析凝胶层析)principle of separating riboflavin(核黄核黄素素)and casein by Sephadex G-75welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experienceprinciple1.Conception Gel chromatography,inanalytical chemistry,technique for separating chemical substances by exploiting the differences in the rates at which they pass through a bed of a porous,semisolid substance(gel).The method is especially useful for separating enzymes,proteins,peptides,and amino acids from each other and from substances of lowmolecular weight.Gel Chromatography Gel Filtration(Porath,Flodin,1959)Gel permeation chromatography(GPC)Size-exclusion chromatography(SEC)molecular sieve chromatography (Hjertn,Mosbach,1962)exclusion chromatography(Pedersen,1962)2.2.固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空三维空间网状结间网状结构构交交联联剂剂越越多多 交交联联度度越越大大 网网孔孔结结构构越越紧紧密密交交联联剂剂越越少少 交交联联度度越越小小 网网孔孔结结构构越越疏疏松松Sephadex Beads are prepared by cross-linking dextran(葡聚糖葡聚糖)with epichlorohydrin(环氧氯丙烷环氧氯丙烷).Widely used in industrial processes.Also useful in desalting(脱盐脱盐)and buffer exchange.SephadexSephadex的分级范的分级范围围 G10 700G15 1,500G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000吸水性吸水性*G*G类的型号类的型号每克干凝胶吸每克干凝胶吸水量（水量（mlml）x 10 10*如如G-75G-75每克干凝胶吸每克干凝胶吸水量为水量为7.5 ml7.5 ml样品样品固定相流流动动相相小分子小分子被被延滞延滞小分子小分子大分子大分子较较快流出快流出molecular sieve effect(分子筛效应分子筛效应)V Ve e-V-Vo o K Kd d=V Vi i分配系数分配系数K Kd d ：特点：特点1 1）与被分离物质分子的大小）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关和凝胶颗粒孔隙的大小有关 （2 2）与柱的长短粗细无关）与柱的长短粗细无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数有一个特定的分配系数 (K(Kd d)应应 用用脱脱 盐盐测分子量测分子量分离纯化分离纯化VeAlbuminNaClVeVe优点缺点凝胶层凝胶层析的优析的优缺点缺点凝胶是一种不带电荷的凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定惰性载体，结构稳定要求要求样品和洗脱液的样品和洗脱液的粘粘度很低度很低操作条件较温和操作条件较温和凝胶颗粒网络凝胶颗粒网络孔径大小孔径大小有限有限,可被纯化物质的可被纯化物质的分子量范围受限制分子量范围受限制样品得率高样品得率高,重复性好重复性好,可进行大量分离纯化可进行大量分离纯化凝胶结构凝胶结构对某些分子具对某些分子具有吸附作用有吸附作用(1)(1)棉花装填量及松紧度适中；棉花装填量及松紧度适中；(2)(2)凝胶不能有气泡和分层现象；凝胶不能有气泡和分层现象；(3)(3)装柱结束后保持凝胶表面平整。装柱结束后保持凝胶表面平整。1.1.装柱装柱使用滴管，柱床表面以上洗脱液不得流干。使用滴管，柱床表面以上洗脱液不得流干。NotesNotes2.2.洗脱洗脱3.3.加样加样(1)(1)洗脱液液面与凝胶柱床表面相切，关闭出口；洗脱液液面与凝胶柱床表面相切，关闭出口；(2)(2)加样时使用滴管，尽量不破坏凝胶表面；加样时使用滴管，尽量不破坏凝胶表面；(3)(3)样品进入凝胶后再加缓冲液开始洗脱。样品进入凝胶后再加缓冲液开始洗脱。