凝胶电泳应用于糖蛋白的分离鉴定.pptx

二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定目 录糖蛋白1糖基化2凝胶电泳分离纯化技术3基于PAS反应的染色方法4定义定义由短的寡糖链与蛋白质共价结合构成的分子。特点特点蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为蛋白质的特性。细胞膜、溶酶体、细胞外液 分布分布糖蛋白（glycoprotein）膜蛋白中的糖膜蛋白分子中的糖这些寡糖链常常是具分支的杂糖链，不呈现重复的双糖系列，一般由2-10个单体（少于15）组成，未端成员常常是唾液酸或L-岩藻糖。糖蛋白的结构单糖的种类葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)岩藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神经氨酸(NeuAc)连接方式N-连接：O-连接：糖蛋白的结构糖基化糖基化糖基化 是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之一，是必需的生理过程，对蛋白质生物学功能的正确发挥起着至关重要的作用。糖蛋白的形成是糖基化的一种表现形式糖基化生物活性折叠溶解度半衰期抗原性蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质糖链糖链糖蛋白 分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤糖蛋白的分离纯化方法Capillary electrophoresisCapillary electrophoresis毛细管电泳毛细管电泳MLCMLC多维液相色谱多维液相色谱electroblottillg电印迹技术gelelectrophoresis凝胶电泳电泳技术的基本原理v电泳：带电粒子在电场中的定向移动。电泳：带电粒子在电场中的定向移动。等电聚焦(Isoelectro focusing IEF)vv原理原理 PrPrPrPr为两性电解质，不同为两性电解质，不同为两性电解质，不同为两性电解质，不同PrPrPrPr其其其其aaaaaaaa的数量、种类及占比的数量、种类及占比的数量、种类及占比的数量、种类及占比例不同，因此例不同，因此例不同，因此例不同，因此pIpIpIpI不同，不同，不同，不同，pIpIpIpI范围窄且净电荷为零，因此依范围窄且净电荷为零，因此依范围窄且净电荷为零，因此依范围窄且净电荷为零，因此依pIpIpIpI分离分离分离分离PrPrPrPr。EFEFEFEF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的形成从阳极到阴极逐步增加的形成从阳极到阴极逐步增加的形成从阳极到阴极逐步增加的pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度(连续的连续的连续的连续的,稳定的稳定的稳定的稳定的,线性的线性的线性的线性的pH)pH)pH)pH)。vv原理原理 当当当当PrPrPrPr在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的PIPIPIPI时，由于净电荷为零，时，由于净电荷为零，时，由于净电荷为零，时，由于净电荷为零，不再移动。不再移动。不再移动。不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到引它回到引它回到引它回到pIpIpIpI位置。因此位置。因此位置。因此位置。因此PrPrPrPr只能在只能在只能在只能在pIpIpIpI位置被浓缩成窄、稳位置被浓缩成窄、稳位置被浓缩成窄、稳位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。定的带。称这种浓缩效应为聚焦。定的带。称这种浓缩效应为聚焦。定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的只要凝胶中的只要凝胶中的只要凝胶中的pHpHpHpH梯度范围足够窄。便可将梯度范围足够窄。便可将梯度范围足够窄。便可将梯度范围足够窄。便可将pIpIpIpI相近的相近的相近的相近的PrPrPrPr分开，分开，分开，分开，EFEFEFEF是电泳技术中分辨率最高的技术。是电泳技术中分辨率最高的技术。是电泳技术中分辨率最高的技术。是电泳技术中分辨率最高的技术。等电聚焦(Isoelectro focusing IEF)等电聚焦(Isoelectro focusing IEF)返回返回返回返回聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)vv聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称Acr)Acr)和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(N(N,N N-methylenemethylene-bisacylamidebisacylamide,简称简称Bis)Bis)在加速剂在加速剂 N N,N N,N N,N N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N(N,N N,N N,N N-tetramtetram-ethyl ethylenedia mineethyl ethylenedia mine，简称，简称TEMED)TEMED)和催化剂过硫酸铵和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate(NH(ammonium persulfate(NH4 4)2 2S S2 2O O3 3，简称，简称AP)AP)或核或核黄素黄素(ribofavin(ribofavin即即vita min B2vita min B2,C C1717H H2 2O O6 6N N4 4)的作用下聚合交联成三维网状的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)PAGE)。电泳过程示意图电泳过程示意图电泳过程示意图电泳过程示意图 A A A A为电泳前为电泳前为电泳前为电泳前3 3 3 3层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，3 3 3 3层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子 B B B B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C C C C显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳插入梳子插入梳子聚丙烯酰胺凝胶电泳加缓冲液加缓冲液加加 样样聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳电泳剥胶剥胶聚丙烯酰胺凝胶电泳vv标准标准MarkerMarker蛋白的电泳图谱蛋白的电泳图谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳可直接在胶上对糖蛋白进行酸水解或酶解后进行后续的鉴定分析或糖链的结构分析。可以同时分离多个复杂混合物优势优势双向凝胶电泳（二维电泳）双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。二维电泳胶性 PH9中电加解入质了溶双液 PH3加上电场后建立稳定PH梯度蛋白质溶液加入，建立电场染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开第一向等电聚焦等电聚焦PI逐渐降低等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量逐渐降低PI 逐渐降低 双向凝胶电泳示意图双向凝胶电泳示意图二维电泳vv染色染色 二维电泳1基于PAS反应的染色方法3GelCode糖蛋白染色试剂盒2硼酸根荧光染料二维电泳中糖蛋白的染色方法基于PAS反应的染色方法PAS-periodic acid-Schiffs base method(高碘酸/过碘酸-席夫式碱方法)原理原理 在过碘酸的作用下，糖蛋白中糖链上相邻两个碳原子上的羟基被氧化成醛基，醛基再与带有紫外或荧光基团的氨基形成席夫式碱，在紫外或荧光灯下检测即可。席夫式碱N原子和C原子双键结合的一类化合物基于PAS反应的染色方法酸性品红丹酰肼荧光试剂丹磺酰甘氨酰肼荧光试剂Pro-Q Emerald类染料过碘酸作用显紫红色对还有唾液酸的糖蛋白灵敏染色7天灵敏度低g高碘酸作用醛基与胺基反应形成腙染色2天灵敏度低40 ng反应条件苛刻酸性条件灵敏度低10-20 ng糖蛋白染色专一性高，适用于未知样品的鉴定分析和样品纯度的鉴定美国新发明的一种糖蛋白鉴定试剂盒反应条件温和灵敏度极高糖基化位点表达程度图谱荧光标记物结构尚未公开