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影响影响 PCR 扩增因素的分析扩增因素的分析 摘要摘要:PCR 的发展可以说是从 DNA 合成酵素的发现缘起。DNA 合成酵素最早于 1955 年发现(DNA polymerase I),而较具有实验价值及可得性的 Klenow fragment of E.Coli 则是于 70 年代的初期由 Dr.H.Klenow 所发现,但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素,因此不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化，PCR 技术的广泛应用，研究 PCR 技术的影响因素闲的愈来愈重要。关键词关键词:多聚酶链式反应 PCR 扩增技术 多重 PCR 1 1PCRPCR 技术的原理技术的原理 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按 碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟，23 小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍1。聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)，又称无细胞克隆技术(FreeBacteria Cloning Technique)，是一种根椐生物体内 DNA 复制的某些特点而设计的，在体外对特定 DNA 序列进行快速扩增的技术。2 2PCRPCR 技术的发展技术的发展2.12.1 常规常规 PCRPCR 检测检测对细菌进行分类鉴定的常规 PCR 技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体 RNA(rDNA)、gyrB 基因、toxR 基因等。自6O 年代末，Woese 首次运用 rDNA 分析生物的系统发育以来，rDNA 数据库快速扩大，已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA 基因核苷酸序列具有高度保守性，它的序列变化与进化距离相适应，被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生 1的碱基变化，所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌 16SrDNA 最直接的方式就是通过基因测序并与 Genbank、EMBL、DDB 等国际通用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA 基因也是非常保守的序列，由于它与16SrDNA 基因是线性串联排列，在此基础上就发展出利用 16S-23SrDNA 基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于 16S rDNA，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外，还有其它一些高度保守的序列，如 gyrB 基因(细菌中广泛存在的一种编码 DNA 的拓扑异构酶的 B 亚基的单拷贝基因)、toxR 基因(弧菌中的毒素表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。2.22.2 多重多重 PCRPCR 技术技术多重 PCR 技术是在常规 PCR 基础上改进并发展起来的一种新型 PCR 扩增技术，其检测原理与传统 PCR 相同.如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入 1 对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出 l 条以上的目的 DNA 片段。使用这一方法可以同时检测 1 个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。，可同时检测多种病原微生物。该技术自 1988 年 Chamberlain 首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来，已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。23.3.影响影响 PCRPCR 技术的因素研究进展技术的因素研究进展 3.1 PCRPCR 扩增影响因素初探扩增影响因素初探多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction)简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA 片段的技术，此法操作简便,可在短时间内获得数百万个特异性DNA序列的拷贝。影响PCR 反应结果的因素较多，其中如何获得高质量的基因组DNA 模板以及PCR 反应体系中各种成分因子的优化组合，是获得清晰可重复的扩增产物的前提，也是扩增反应能否成功的关键。3为保证反应结果的稳定性和可靠性，同时降低反应成本，必须系统地探讨基因组中DNA 的PCR反应体系中各种因素对扩增结果的影响，对PCR 进行优化，以期为目地基因PCR 反应成功提供稳定可靠的方法。通过对实验条件进行摸索，确定最佳的PCR 反应体系和反应条件，排除人为因素（如加样错误），据此反应体系和条件均能较好地扩增目标片段。实验结果发现PCR 反应混合物成分的比例和PCR 反应条件是PCR 反应成功的关键，为了保证高质量的PCR 扩增产物应注意以下几点：DNA 模板的要求；引物与模板之间的比例，对PCR 的特异性也是非常重要的。dNTP 浓度过高可加快反应速度，但同时增加碱基的错误掺入率即错配率和实验成本,而低浓度的dNTP 会降低反应速度以及产物量，但可以提高实验的精确度。PCR 反应的缓冲液。3.23.2理化因素对人发理化因素对人发DNADNA PCRPCR扩增结果的影响扩增结果的影响受高温、酸、碱、日晒、雨淋等环境因素的作用,致使其人发DNA发生质和量的变化,影响DNA分析结果。用聚合酶链反应(PCR)可对人体的一些组织,如血痕、毛发及牙齿等进行性别鉴定4。实验研究了温度、湿度、pH、福尔马林、乙醇和土埋处理牙齿的PCR扩增,pH可影响DNA的稳定性,但pH在一定范围仍较稳定。pH过高或过低均可引起DNA 双链间氢键的破坏而变性,甚至也可引起链内共价键的破坏而发生DNA降解；福尔马林固定组织可以破坏DNA分子,固定时间越长DNA 降解越多,大部分DNA都降解成小片段,不适合RFLPs 分析。总之，实验最后证实温度、pH等均会影响PCR扩增。环境条件是复杂多样的,对检材DNA的影响既可以是单因素作用,也可能是多因素同时作用,现仅报道部分理化单因素对人发DNA及其PCR性别鉴定结果的影响,其他问题尚待进一步研究。3.33.3影响多重影响多重PCRPCR扩增效果的因素扩增效果的因素多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。实验进行不同循环参数、PCR缓冲液及反应体积的对比，结果表明，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR 的扩增效果，而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。在常规PCR 中，一个反应体系一般采用一个退火温度。有些研究小组的多重PCR 反应条件也采用一个退火温度，但也有一些研究小组在一个反应体系中采用多个退火温度。常规PCR 缓冲液使用标准缓冲液，由15mmol/LMg2+，10mmol/L TrisHC1(PH83)和50mmol/LKC1组成10。有文献报道TMAC、TritonX 100、明胶能增强PCR扩增的特异性10。因而，在多重PCR缓冲液中常加入1mmol/L TMAC和01TritonX 1O0。经过多次对比实验，我们认为多重PCR理想的缓冲液为：15mmol/LMgC12，50mmol/L KC110mmol/L TrisHC1 pH一831mmol/LTMAC，01 TritonX 100，001 明胶。多重PCR(mutiplex PCR)技术因具有高效、高产率、能降低实验成本、加速实验进程等优点，白1988年Chambercian等首次提出这一概念起5、6，该技术已被广泛的应用于基因组结构与功能基因及数量性状基因座(quantitative traitlocus，QTL)的定位等研究7-9。多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。此外，如须用激光诱导荧光电泳技术，如ABI373、ABI 377、ABI 3700、CEQ 2000等系列DNA序列分析仪分辨多重PCR的扩增产物，标记在引物5 端的荧光物质发生荧光衰变，影响多重PCR扩增产物的检测。本实验以328对5 端标有HEX或TET或6一FAM 亚磷酸酰胺的引物及4O只cAU资源家系6F。为材料，进行循环参数、PCR缓冲液及反应体积的多重PCR优化反应体系对比实验。实验结果表明循环参数、PCR缓冲液成分等影响多重PCR 的扩增，而反应体积和循环次数对其扩增效果影响较小。参考文献参考文献：1张世秀，张新中，谢珍玉，周永灿。PCR 技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用.现代渔业信息,2006 年 7 月 第 2l 卷 第 7 期 P11-132张玉霞，黄鸣.食品检验中多重 PCR 技术的应用.中国卫生检验杂志,2008年 5 月第 18 卷第 5 期 P958-9603C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒.PCR 技术实验指南M.北京：科学出版社，1998.4吴梅摘,孙光云.分析扩增D N A 序列侧定人发的性别.法医学杂志,1 9 9 1;7(l),15 Chambercian J S，Gibbs R A，Ranier J E，et a1Detection screening of the duchenne m uscular dystrophy locus via m utiplex DNA amplification EJNucl Acids Res，1988(16)：1 141 l156Ez3 6 Mullis K，Falcoma F，Scharf S，et a1Specific amplification of DNA in vitro：the polym erase chain reaction，Cold Spring Habor Syrup Quant Biol，1986，51：267 Ponce M R，Robles P，Micol J LHigh throughput genetic mapping in Arabidopsos thalianaJMol Gen Genet，1999，261：4O8 4158 Rosenfield S I，Jaykus L AA multiplex reverse transcription polymerase chain reaction method for the detection of foodborne virusesJJ Food Prot，1999，62：121012149 邹浪萍，杨 燕，褚嘉韦占，等多重PCR检测CSFIPO，TPOX和THO1基因座在中国汉族中的多态性J遗传学报，1998，25(3)：199 20410J萨姆布鲁克，E F 费里奇，T曼尼阿蒂斯著，(金冬雁，黎孟枫译)分子克隆实验指南M北京：科学出版社，1996，680