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第 4 卷 第 1 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.1 2013 年 2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb.,2013 基金项目:国家高技术研究发展计划 863 计划项目(2010AA023001)、北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目 Fund:Supported by the National High Technology Research and Development Program of China(2010AA023001)and Beijing Municipal Senior Technical Training Plan in Health System*通讯作者:邵兵,研究员,主要研究方向为食品安全保障技术。E-mail:*Corresponding author:SHAO Bing,Professor,Beijing Center for Disease Control and Prevention,No.16,Hepingli Middle Street,Dongcheng District,Beijing 100013,China.E-mail: 超高压液相色谱-串联质谱法测定鱼 组织中卡巴氧及喹乙醇代谢物 赵 珊,郭巧珍,张 晶,邵 兵*(北京市疾病预防控制中心,食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室,北京 100013)摘摘 要要:目的目的 建立鱼组织中卡巴氧代谢物喹恶啉-2-羧酸(QCA)及喹乙醇代谢物 3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)的超高压液相色谱-串联四极杆质谱(UPLC-MS/MS)残留分析方法。方法方法 样品在一定温度、Tris/HCL缓冲溶液作用下,经蛋白酶酶解,浓盐酸酸化,乙酸乙酯提取,提取液吹干后加入 20%甲醇水溶解,过 PAX 固相萃取柱净化、富集;以乙腈-0.1%甲酸水为流动相,经 HSS T3 色谱柱分离,采用多反应监测(MRM)正离子模式进行检测。结果结果 QCA 和 MQCA 定量限(LOQ)均为 0.5 g/kg,在 0.55.0 g/kg 添加水平的平均回收率在93.1%101.2%之间,相对标准偏差为 1.4%5.5%。结论结论 本方法适用于鱼组织中卡巴氧及喹乙醇代谢物残留检测。关键词关键词:喹恶啉-2-羧酸;3-甲基-喹恶啉-2-羧酸;超高压液相色谱-串联质谱法 Determination of metabolites of carbadox and olaquindox in fish tissue using ultra pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry ZHAO Shan,GUO Qiao-Zhen,ZHANG Jing,SHAO Bing*(Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning,Beijing Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100013,China)ABSTRACT:Objective An analytical method for the detection of quinoxaline-2-carboxylic acid(QCA)and 3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA),which were metabolites of carbadox and olaquindox,respectively,by ultra-pressure liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was established.Methods The enzymolysis of sample within Tris/HCl buffer under stable temperature was acidized by hydrochloric acid and extracted by ethyl acetate.The layer of ethyl acetate was evaporated to be nearly dry under a gentle stream of nitrogen.The residue was dissolved with methanol-water(1:4,v/v),and separated and purified by PAX cartridge.The objective compounds were separated using HSS T3 column with acetonitrilewater0.1%formic acid)as mobile phase and analyzed by mass spectrometry in the positive electrospray ionization under multiple reaction monitoring mode(MRM).Results The LOQ for QCA and MQCA were both 0.5 g/kg.The average recoveries were from 93.1%to 101.2%at the spiked level of 0.55.0 g/kg with the relative standard deviation of 1.4%5.5%.Conclusion The method is suitable for the detection of residual pollutant in fish tissues.第 1 期 赵 珊,等:超高压液相色谱-串联质谱法测定鱼组织中卡巴氧及喹乙醇代谢物 125 KEY WORDS:quinoxaline-2-carboxylic acid;methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid;ultra pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)卡巴氧(carbadox)和喹乙醇(olaquindox)同属喹噁啉-1,4-二氧化物,由于其具有明显地抗菌和促生长作用,曾在养殖业广泛使用。卡巴氧具有遗传毒性和致癌嫌疑,喹乙醇有强的蓄积毒性和致突变性,喹乙醇在鱼体内易降解,降解代谢物能抑制脱氧核糖核酸的合成,对染色体畸变有一定影响,属致癌物1,欧盟于 1998 年发文禁止在饲料中添加卡巴氧和喹乙醇。我国目前还没有完全禁止使用这类药物,在一些养殖行业仍在使用,甚至出现滥用。因此建立灵敏、可靠的检测方法对其实施监测十分必要。噁喹啉-2-羧酸(QCA)是卡巴氧在动物体内产生的代谢物;3-噁甲基喹啉-2羧酸(MQCA)是喹乙醇在动物体内产生的代谢物。QCA 和 MQCA 在体内相对稳定,分别为卡巴氧和喹乙醇的残留标示物。QCA和 MQCA 检测的方法已有很多文献报道,其中最常用的是液相色谱法2-4和液相色谱-质谱联用法5-10,本研究在前人研究工作的基础上,对样品前处理方法进行了改进,建立了鱼组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物的 UPLC-MS/MS 检测方法。1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 ACQUITYTM超高压液相色谱仪、Xevo TQ 三重四极杆串联质谱仪(美国 Waters公司);Milli-Q超纯水器(美国 Millipore 公司);HZQ-C 空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);BOND ELUT PLEXA PAX(60 mg,3 mL)固相萃取柱(美国 Agilent公司),使用前依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水活化,保持柱体湿润。喹 恶 啉-2-羧 酸(C9H6N2O2,97%,美 国Sigma-Aldrich公 司);3-甲 基 喹 恶 啉-2-羧 酸(C10H8N2O2,94%,德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司);喹恶啉-2-羧酸-d4(C9H6N2O2,99.5%,德国 WITEGA公司);蛋白酶(P5147,美国Sigma公司);Tris碱(进口分装,国药集团化学试剂有限公司);酶消解液为 0.2 mol/L Tris/HCL 缓冲溶液(含 0.1 mol/L 氯化钙,pH 9.60.2)8,4 保存。甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯,Dikma Pure 公司);甲酸(98%,比利时 Acros Organics 公司);盐酸(优级纯,北京兴青红精细化学品科技有限公司);氨水(优级纯,北京化工厂)。标准储备液的制备:分别准确称取喹恶啉-2-羧酸、3-甲基喹恶啉-2-羧酸、喹恶啉-2-羧酸-d4 标准品5.0 mg(按纯度示值折算),用甲醇溶解并定容至 10 mL,配制成 500 mg/L 的标准储备液,20 以下避光存放,可使用 12 个月。蛋白酶溶液:准确称取一定量蛋白酶,加入纯水溶解、定容,配置的酶液浓度为 10 mg/mL,现用现配。1.2 样品预处理 龙利鱼沿背脊取肌肉,充分绞碎,匀质。20 以下避光保存。称取5 g(精确到0.01 g)均质样品于50 mL离心管中,加入质量浓度为100 g/L的QCA-d4内标溶液0.1 mL,加入8 mL 0.2 mol/L pH 9.6 Tris/HCL缓冲溶液和300 L 10 mg/mL蛋白酶水溶液,涡旋混匀,置于空气浴恒温摇床中47 酶解1618 h,取出样品放至室温,加入0.8 mL浓盐酸,振摇混匀,4、9000 r/min离心5 min,将上层清液转移至另一干净的50 mL离心管。加入 6 mL 乙酸乙酯,涡旋 1 min,4、9000 r/min离心5 min,将上层清液转移至干净的15 mL离心管。重复乙酸乙酯提取步骤,合并上清液,35 下氮吹浓缩至干,残渣用 10 mL 20%甲醇水溶解。提取液转移至经活化的 PAX 固相萃取柱中,依次用 3 mL 水、3 mL 2%氨水、3 mL 甲醇和 3 mL 0.5%乙酸-甲醇淋洗 PAX 柱。然后将 PAX 柱抽干,用 6 mL 2%甲酸-甲醇溶液洗脱目标化合物,收集洗脱液,35 下氮吹浓缩至干,用 1.0 mL 50%甲醇-水溶液溶解残渣,过 0.22 m 滤膜,进样,UPLC-MS/MS 测定。1.3 色色谱质谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 m,2.1 mm 100 mm);柱温:40;流动相:A 液为 0.1%甲酸水溶液;B 液为乙腈;流速:0.25 mL/min;进样量:5 L。梯度洗脱程序:0 6.0 min,5%B 线性升至25%;保持 1 min,然后迅速下降至 5%。126 食品安全质量检测学报 第 4 卷 ESI(+)离子源:毛细管电压:2.5 kV;离子源温度:100;锥孔反吹气流量 50 L/h;脱溶剂气温度:350;脱溶剂气流量:540 L/h。2 结果与讨论 2.1 液相色谱-质谱条件的优化 采用多反应监测(MRM)模式,分别对 QCA、MQCA和QCA-d4标准液进行一级离子扫描,确定化合物的电离方式和分子离子,在获得分子离子峰(母离子)质荷比后,再进行二级质谱(子离子)扫描,优化碰撞能量,确定两个丰度比较高的子离子作为定性和定量离子。在 ESI(+)检测模式下,化合物质谱采集参数见表 1。液相色谱流动相选择乙腈-水或甲醇-水均可将QCA、MQCA 在 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离;当进行梯度洗脱时,乙腈-水色谱柱反压变化明显小于甲醇-水体系;而在流动相中加入 0.1%甲酸能增加 ESI(+)模式下的电离效率5,提高检测灵敏度;对色谱柱的选择,比较了 QCA、MQCA 在 ACQUITY UPLC BEH C18柱、ACQUITY UPLC BEH C8柱和ACQUITY UPLC HSS T3 柱上的分离效果,结果表明差异不大;但当样品测定时,采用 ACQUITY UPLC HSS T3 柱基质抑制最小。因此选择 0.1%甲酸水和乙腈为流动相,在 ACQUITY UPLC HSS T3柱上,梯度洗脱分离。龙利鱼样品加标 MRM 色谱图见图 1。表 1 化合物的质谱采集条件 Table1 Mass spectrometric acquisition parameters 化合物 母离子 (m/z)定量离子 (碰撞能量,eV)定性离子(碰撞能量,eV)锥孔电压(V)喹恶啉-2-羧酸 175.0 129(15)131(15)25 3-甲基喹恶啉-2-羧酸 189.0 145(15)143(15)23 喹恶啉-2-羧酸-d4 179.0 133(15)135(15)25 图 1 龙利鱼加标 MRM 色谱图(加标浓度 5 g/kg)Fig.1 MRM chromatograms of target compounds in spiked long lee fish at the spiked level of 5 g/kg 第 1 期 赵 珊,等:超高压液相色谱-串联质谱法测定鱼组织中卡巴氧及喹乙醇代谢物 127 2.2 样品前处理方法的选择 由于 QCA 和 MQCA 等代谢物在动物体内与蛋白质以结合态形式存在,因此,样品预处理的第一步需将化合物转变为游离态,文献报道有酸解3,7、碱解10和酶解5,6,8,9等方式,使用蛋白酶酶解一般需要过夜5,8,酶解后动物组织被破坏,目标化合物呈游离状态,与动物组织分离最为彻底。蛋白酶酶解需要在一定温度和 pH 值条件下进行,欧阳姗5和Hutchinson8分别将酶解条件控制在 47 和 55,经过比较,在两种温度下,酶解都可达到较好的效果,当10 mg/mL蛋白酶水溶液用量为300 L时,能够保证 5 g 样品酶解完全5。由于QCA和MQCA呈弱酸性,水解液经酸化后,QCA 和 MQCA 才能够被乙酸乙酯提取,Hutchinson8用 1 mL 浓盐酸对 QCA 和 MQCA 进行酸化,为此我们进行了考察,分别用 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL浓盐酸酸化,结果表明乙酸乙酯的提取效率无明显差异;但发现随着浓 HCL 的加入,水解溶液中有少量的蛋白不断沉淀析出,浓盐酸的用量为 0.8 mL 时,蛋白析出的量不再增加,蛋白的沉淀析出,可大大减少基质抑制,因此选择加入0.8 mL浓盐酸酸化水解液。Hutchinson8采用 SCX 固相萃取柱净化,用磷酸盐缓冲溶液对乙酸乙酯提取液进行反萃取,过柱后再次酸化,用乙酸乙酯提取,步骤十分繁琐、耗时。赵东豪9则省略了过柱净化步骤,将乙酸乙酯挥干,流动相溶解后进样,后者虽然简便,但基质抑制较大。由于 QCA 和 MQCA 的分子结构中都带有羧基,因此可采用MAX或PAX固相萃取柱进行净化,提取液挥干后用20%甲醇水溶解,在MAX或PAX固相萃取柱上直接上样,淋洗步骤分别为水、2%氨水、甲醇和 0.5%乙酸-甲醇等四步,如果样品含脂肪较多,可将 0.5%乙酸-甲醇更换为乙酸乙酯淋洗,最后用 2%甲酸-甲醇溶液洗脱目标化合物。由图1可见,经过PAX净化,龙利鱼基质加标的色谱峰几乎无杂质干扰。2.3 方法学验证 2.3.1 标准曲线和定量限 配制两种目标物的质量浓度为 2.5100 g/L 的系列混合标准工作液,内标浓度均为 10 g/L,以目标组分峰面积与相应内标峰面积的比值 Y 为纵坐标,以标准工作液的浓度 X(g/L)为横坐标进行线性回归分析,绘制标准曲线。QCA 和 MQCA 的线性方程分别为 Y=1.0044X 0.7532 和 Y=1.2135X1.5282,相关系数(R2)分别为0.9990 和 0.9987。以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于 10(S/N=10)对应的浓度为方法的定量限(LOQ),确定鱼肉样品中 QCA 和 MQCA 的 LOQ 均为 0.5 g/kg。2.3.2 方法回收率实验 分别取龙利鱼空白样品,添加3个浓度水平的混合标准溶液,按 1.2 节样品预处理方法进行处理,UPLC-MS/MS 测定提取液中目标化合物浓度。每个浓度点取 6 份样品进行实验,内标法定量,计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。QCA 和 MQCA 不同加标水平的回收率见表 2。表 2 龙利鱼基质中 QCA 和 MQCA 的回收率和 相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of QCA and MQCA in long lee fish(n=6)化合物 加标水平(g/kg)平均回收率(%)RSD(%)QCA 0.5 95.6 4.3 2.0 101.2 3.6 5.0 99.1 5.2 MQCA 0.5 93.1 4.8 2.0 94.6 1.4 5.0 100.6 5.5 3 结 论 本研究建立了鱼组织中卡巴氧、喹乙醇的残留标示物 QCA 和 MQCA 的高压液相色谱-串联质谱测定方法,样品经过酶解、提取、净化,有效地消除了基质干扰,方法具有较高的灵敏度,以 QCA-d4 作为内标,提高了定量准确性,本方法适用于鱼组织中卡巴氧、喹乙醇的残留监测。参考文献 1 谢小华,周德山,宋向明,等.高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇残留量J.理化检验-化学分册,2011,47(1):102103.Xie XH,Zhou DS,Song XM,et al.Determination of residue of Olaquindox in fishery products by high performance liquid chromatography JPhys Test Chem Anal B:Chem Anal,2011,47(1):102103 128 食品安全质量检测学报 第 4 卷 2 全国水产标准化技术委员会.农业部 1077 号公告-5-2008 水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法S.National Fisheries Technical Committee of Standardization.Ministry of Agriculture,1077 Bulletin-.5-2008 Determination of olaquindox metabolite residues in fishery products by high performance liquid chromatography S.3 Wu YJ,Yu H,Wang YL,et al.Development of a high-perfo-rmance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues J.J Chromatogr A,2007,1146(1):17.4 姚蕴珊,沈建忠,吴聪明,等.高效液相色谱法测定猪肝组织中 3-甲基喹喔啉-2-羧酸J.中国畜牧兽医,2011,38(2):187190.Yao YS,Shen JZ,Wu CM,et al.Determination of 3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid in porcine liver tissues by high performance liquid chromatography J.China Anim Husb Vet Med,2011,38(2):187190.5 欧阳姗,庞国芳,谢丽琪,等.动物组织中卡巴氧和喹乙醇以及相关代谢产物的液相色谱-串联质谱检测方法J.分析测试学报,2008,27(6):590594.Ou YS,Pang GF,Xie LQ,et al.Determination of the residuess of carbadox,olaquindox and related metabolites in bovine and por-cine muscle and liver tissues by LC-MS/MS J.J Instrum Anal,2008,27(6):590594.6 Merou A,Kaklamanos G,Theodoridisa G.Determination of Carbadox and metabolites of Carbadox and Olaquindox in muscle tissue using high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry J.J Chromatogr B,2012,881882:9095.7 Zhang XJ,Zheng B,Zhang H,et al.Determination of marker residue of olaquindox in fish tissue by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J.J Sep Sci,2011,34(4):469474.8 Hutchinson MJ,Young PB,Kennedy DG.Confirmation of carbadox and olaquindox metabolites in porcine liver using liquid chromatographyelectrospray,tandem mass spectrometry J.J Chromatogr B,2005,816:1520.9 赵东豪,黎智广,杨金兰,等.高效液相色谱一串联质谱测定水产品中残留的喹乙醇代谢物J.分析试验室,2010,29(9):1922.Zhao DH,Li ZG,Yang JL,et al.Determination of residue of Olaquindox metabolites in fishery products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J.Chin J Anal Lab,2010,29(9):1922.10 Hutchinson MJ,Young PY,Hewitt SA,et al.Development and validation of an improved method forconfirmation of the carba-dox metabolite,quinoxaline-2-carboxylic acid,in porcine liver usingLC-electrospray MS-MS according to revised EU criteria forveterinary drug residue analysis J.Analyst,2002,127:342346.(责任编辑:赵静)作者简介 赵珊,主任技师,主要研究方向为食品安全检测。E-mail:ms_ 邵兵,研究员,主要研究方向为食品安全保障技术。E-mail: