PCR-RFLP方法检测和鉴别五种李斯特菌.pdf

第 4 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.2 2013 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr.,2013 基金项目:福建省社会发展重点项目(2010Y0049)Fund:Supported by Livelihood Improvement Key Project of Fujian Province of China(2010Y0049)*通讯作者:陈信忠,研究员,博士,主要研究方向为动物传染病学。E-mail:*Corresponding author:CHEN Xin-Zhong,Professor,Technology Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,No.2165,Hai-cang Jian-gang Road,Xiamen 361026,China.E-mail: PCR-RFLP 方法检测和鉴别五种李斯特菌 郭书林,陈信忠*,龚艳清,杨俊萍,叶妍妍,孔繁德(厦门出入境检验检疫局,厦门 361026)摘摘 要要:目的目的 建立快速检测和鉴别单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌等 5 种常见李斯特菌的方法。方法方法 采用 PCR-RFLP 技术,首先通过引物“Lis1A-Lis1B”对李斯特菌属 iap 基因进行扩增,扩增产物大小约 1.4 kb,然后用限制性内切酶 Dde 对 PCR 产物进行酶切,电泳观察具有种间特异性的酶切谱带进行鉴别。结果结果 上述 5 种李斯特菌的 PCR 扩增产物经内切酶 Dde 消化后,得到片段大小不同、具有种间差异的特异性酶切图谱。结论结论 本实验建立的 PCR-RFLP 方法可以用于上述 5 种常见李斯特菌的快速检测和鉴定。关键词关键词:李斯特菌；限制性片段长度多态性聚合酶链反应；检测；鉴定 Rapid detection and identification of five Listeria species by PCR-RFLP GUO Shu-Lin,CHEN Xin-Zhong*,GONG Yan-Qing,YANG Jun-Ping,YE Yan-Yan,KONG Fan-De(Xiamen Entry-Exit Inspection and Qquarantine Bureau,Xiamen 361012,China)ABSTRACT:Objective To establish a method to detect and identify five type strains of Listeria species such as Listeria monocytogenes,L.ivanuii,L.innocua,L.welshimeri and L.grayi.Methods The 1.4 kb gene iap from all members of the genus Listeria was amplified by using specific primers“Lis1A-Lis1B”,then cut by restriction endonuclease Dde.The different Listeria species could be identified through the specific enzyme spectrum of electrophoresis.Results The PCR amplification product of the five Listeria species were di-gested by Dde,and different sizes of fragments and species-specific endonuclease map were gotten.Conclu-sion This method with PCR-RFLP can be used to detect and identify the five common Listeria species rap-idly.KEY WORDS:Listeria species;PCR-RFLP;detection;identification 1 引 言 李斯特菌在自然界分布较广,由李斯特菌感染引起的食物中毒等严重食品安全问题被越来越多的国家和政府所关注。目前国际上公认的李斯特菌属的细菌共有 6 种：单增李斯特菌(Listeria monocy-togenes)、绵羊李斯特菌(L.ivanovii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔李斯特菌(L.welshimeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)和西尔李斯特菌(L.seeligeri)1。其中单增李斯特菌常常污染鲜奶等食物,是最致命的食源性病原体之一,能引起人、畜的李斯特菌病,表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多等2,严重时可第 2 期 郭书林,等:PCR-RFLP 方法检测和鉴别五种李斯特菌 505 引致死亡,其致死率甚至比沙门氏菌和肉毒杆菌更高3。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实可能是单增李斯特菌的感染源4,5。绵羊李斯特菌主要危害动物,特别是反刍类动物,表现为败血症和流产,对人类危害较小6；英诺克李斯特菌存在于食品中,当其发生由非溶血性变为溶血性的变异时,对人类具有潜在的致病性7；威尔李斯特 菌8、格氏李斯特菌9和西尔李斯特菌10虽对人和动物的危害相对较小,但因可作为致病李斯特菌检测鉴定的指示菌而受到关注。快速、准确的李斯特菌检测鉴定技术对预防和治疗李斯特菌病具有十分重要的意义。由于李斯特菌的表现型非常相似,国外已有多次非典型菌株缺少典型特征的报道11,致使传统的李斯特菌检测鉴定方法的准确性受到质疑。近年来,随着人们对各种李斯特菌在食品安全中的重要性的认识的加强,目前针对单增李斯特菌的分子生物学检测鉴定方法已有很多报告12,还建立了鉴定西尔李斯特菌13、英诺克李斯特菌14、威尔李斯特菌15、格氏李斯特菌16等的普通 PCR 方法,但这些方法通常仅针对一种李斯特菌进行检测鉴定。Bubert 等报告了可以检测所有李斯特菌的通用PCR引物和方法17,并建立了三重 PCR 鉴定李斯特菌的方法18。Paillard等建立了多种李斯特菌的 PCR-RFLP 鉴定方法19,但操作步骤十分繁琐。为提高李斯特菌的检测效率,本文采用 Bubert 等17 报告的李斯特菌属 iap 基因PCR通用引物,结合 RFLP技术,通过一次 PCR反应和一次酶切反应,以完成对多种李斯特菌的检测鉴定。2 材料与方法材料与方法 2.1 仪器与试剂 2.1.1 实验菌株 实验所用参考菌株由福建省疾病预防控制中心提供,菌株标准号分别为：单核细胞增生李斯特菌为CMCC(B)54002、绵羊李斯特菌为 ATCC19119、威尔 李 斯 特 菌 为 ATCC35897、格 氏 李 斯 特 菌 为ATCC25401 和英诺克李斯特菌为 ATCC33090。2.1.2 实验试剂 细菌基因组 DNA 提取试剂(TaKaRa Mini BEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit)；10扩增缓冲液 5 L(FERMENTAS 公司)；Taq DNA 聚合酶(上海生工生物工程有限公司),琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和限制性内切酶 Dde(天根生化科技有限公司)；引物合成(大连宝生物工程有限公司)。2.1.3 主要仪器 Veriti 96 孔板 PCR 扩增仪(美国应用生物系统公司)、AllegraX 22R 低温冷冻高速离心机(美国贝克曼库尔特公司)、电泳仪(瑞典安玛西亚公司)、自动凝胶成像分析系统(美国 BioRad 公司)、恒温培养箱(美国热电公司)。2.2 实验方法 2.2.1 引物设计与合成 根据 Bubert 等17报告的可用于特异性扩增李斯特菌属 iap 基因的通用引物,上游引物有 Lis1A 和UnilisA 两条,序列分别为 Lis1A：5-ATGAATAT-GAAAAAAGCAAC-3；UnilisA：5-GCTACAGCTG-GGATTGCGGT-3。下游引物均为 Lis1B：5-TTATAC-GCGACCGAAGCCAAC-3。2.2.2 核酸提取 分别取各种李斯特菌的纯化培养液 1 mL,置于无菌的 Eppendorf 管中,12000 r/min 离心 1 min,去上清,用灭菌蒸馏水洗涤两次,收集菌体；按照细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取细菌DNA,操作步骤见说明书。DNA 溶液置 4 保存备用。2.2.3 李斯特菌特异性 PCR 扩增 PCR 反应体系为 10扩增缓冲液 5 L(FERME-NTAS 公司),4 种 dNTP 各 200 mol/L,上、下游引物(Lis1A、Lis1B)各 0.5 mol/L,DNA 模板 2 g,Taq DNA 聚合酶 2 u,MgCl21.5 mmol/L,加 ddH2O 至 50 L。轻轻混匀,稍离心。反应条件为：95 变性 3 min；95 15 s、58 30 s、72 45 s,35 个循环；72 延伸 5 min。2.2.4 测序 通过 DNA回收试剂盒回收 PCR目的片段,操作步骤按试剂盒说明书。回收的 PCR 产物的 DNA 测序工作由大连宝生物工程有限公司完成。序列结果在GenBank 中进行比对验证。2.2.5 PCR 产物的酶切 回收的 PCR 产物经限制性内切酶 Dde消化,操作步骤如下:在 200 L 灭菌 PCR 管中加入 DNA 0.52.5 g,10酶切 buffer 5.0 L,最后加入限制性内切酶 Dde 2.55 u,加 ddH2O 至 50 L;轻轻506 食品安全质量检测学报 第 4 卷 混匀,稍离心;将 PCR 管置于 37 水浴消化 1 h。2.2.6 消化产物电泳 内切酶 Dde 的消化产物电泳上样量为 10 L,点样于 1%琼脂糖凝胶(含 0.5 g/mL 溴化乙锭),以2000 bp Marker 为标准分子参照,以 5 V/cm 的电场强度于 0.5TBE 电泳缓冲液中电泳 30 min；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照。3 结果与讨论结果与讨论 3.1 目的片段的酶切位点分析 应用酶切位点分析软件 NEBcutter V2.0 对GenBank 中公布的 6 种李斯特菌的 iap 基因序列进行酶切位点分析。发现限制性内切酶 Dde的酶切位点CTNAG可使 6种李斯特菌 iap基因产生特异性的酶切片段,如表 1 所示。PCR-RFLP 标准图谱如图 1 所示。3.2 PCR 结果 应用引物“Lis1A-Lis1B”对 5 种李斯特菌 iap基因进行 PCR 扩增,得到与预期片段大小相符合的目的片段。PCR 产物回收后测序,得到 5 种李斯特菌的扩增片段大小分别为：格氏李斯特菌 1536 bp,单增李斯特菌 1459 bp,威尔李斯特菌 1575 bp,绵羊李斯特菌 1572 bp,英诺克李斯特菌 1398 bp(图 2)。这些李斯特菌的基因序列(结果未显示)经与 GenBank中相应的李斯特菌基因序列进行比对,同源性均达到 99%以上。表 1 酶切位点和酶切片段 Table 1 Restriction site and virtual restriction fragment 菌名 引物 PCR 产物大小(bp)酶切位点 酶切片段(bp)Lis1A-Lis1B 1459 无 1459 L.monocytogenes UnilisA-Lis1B 1433 无 1433 Lis1A-Lis1B 1536 75、1218、1306 75、1143、88、230 L.grayi UnilisA-Lis1B 1510 49、1192、1280 49、1143、88、230 Lis1A-Lis1B 1575 602、1161、1357 602、559、196、218 L.welshimeri UnilisA-Lis1B 1549 576、1135、1331 576、1143、88、230 Lis1A-Lis1B 1546 215、411 215、196、1161 L.ivanovii UnilisA-Lis1B 1520 189、385 189、196、1161 Lis1A-Lis1B 1398 119、836 119、717、553 L.innocua UnilisA-Lis1B 1372 93、810 93、717、553 Lis1A-Lis1B 1578 215、411、1184 215、196、773、384 L.seeligeri UnilisA-Lis1B 1552 189、385、1158 189、196、773、384 M:Marker;1-6:格氏李斯特菌,单增李斯特菌,威尔李斯特菌,绵羊李斯特菌,英诺克李斯特菌,西尔李斯特菌 图 1 6 种李斯特菌 PCR-RFLP 标准图谱 Fig.1 PCR-RFLP virtual rectrictionmapper of Listeria species M:Marker;1-6:格氏李斯特菌,单增李斯特菌,威尔李斯特菌,绵羊李斯特菌,英诺克李斯特菌 图 2 引物对“Lis1A-Lis1B”PCR 扩增结果(经三次平行实验,结果一致)Fig.2 PCR result with the primers Lis1A and Lis1B(Test was repeated three times with the same results)第 2 期 郭书林,等:PCR-RFLP 方法检测和鉴别五种李斯特菌 507 采用引物“UnilisA-Lis1B”对 5 种李斯特菌进行PCR扩增,结果该引物不能扩增格氏李斯特菌,可以扩增其余 4 种李斯特菌并得到与预期片段大小相符合的目的片段(图 3)。PCR 产物回收后测序,得到扩增片段大小分别为：单增李斯特菌 1433 bp,威尔李斯特菌 1549 bp,绵羊李斯特菌 1546 bp,英诺克李斯特菌 1372 bp。本实验结果与 Bubert 等17所述该对引物可扩增所有李斯特菌的研究结果不符。将引物UnilisA 与 GenBank 中的格氏李斯特菌标准菌株(ATCC25400)(登录号为：JF967616.1)相应基因序列进行比对,两者存在显著差异,同源性只有 50%,显然该引物不能用于格氏李斯特菌 iap 基因的特异性 扩增。M:Marker;1-5:格氏李斯特菌,单增李斯特菌,威尔李斯特菌,绵羊李斯特菌,英诺克李斯特菌.M:Marker;1-5:L.grayi,L.monocytogenes,L.welshimeri,L.ivanovii,L.innocua.图 3 引物对“UnilisA-Lis1B”PCR 扩增结果(经三次平行实验,结果一致)Fig.3 PCR result with the primers UnilisA and Lis1B(Test was repeated three times with the same results)实验证明,引物对“Lis1A-Lis1B”可以对上述 5种李斯特菌 iap 基因进行扩增,符合实验要求。引物对“UnilisA-Lis1B”因不能扩增格氏李斯特菌 iap基因,不符合实验要求。3.3 RFLP 结果 李斯特菌 iap 基因的 PCR 产物经限制性内切酶Dde消化后,产生的酶切谱带与理论值相符。引物对“Lis1A-Lis1B”的扩增产物酶切谱带结果为,格氏李斯特菌酶切谱带2条,分别约为230 bp和1140 bp；单增李斯特菌不被酶切,保持1400 bp左右的PCR产物片段；威尔李斯特菌酶切谱带为 3 条,分别约为600、560 和 200 bp；绵羊李斯特菌具有 2 条约 1160 bp和 200 bp 的酶切谱带；英诺克李斯特菌酶切谱带 2条,分别约为 710 bp 和 550 bp(图 4)。由图 4 可见,不同种李斯特菌的酶切谱带具有种间差异,根据酶切谱带即可鉴定李斯特菌菌种。M:Marker;1-5:格氏李斯特菌,单增李斯特菌,威尔李斯特菌,绵羊李斯特菌,英诺克李斯特菌.M:Marker;1-5:L.grayi,L.monocytogenes,L.welshimeri,L.ivanovii,L.innocua.图 4 PCR-RFLP 电泳图(Lis1A-Lis1B)(经三次平行实验,结果一致)Fig.4 PCR-RFLP rectrictionmapper(Lis1A-Lis1B)(Test was repeated three times with the same results)引物对“UnilisA-Lis1B”的 PCR 产物酶切结果如图 5 所示,4 种被 PCR 扩增的李斯特菌均可产生特异的酶切谱带。但鉴于该对引物不能扩增格氏李斯特菌,所以采用该引物对的 PCR-RFLP 方法只能用于除格式李斯特菌以外的多种李斯特菌的鉴别。M:Marker;1-4:单增李斯特菌,威尔李斯特菌,绵羊李斯特菌,英诺克李斯特菌.M:Marker;1-4:L.monocytogenes,L.welshimeri,L.ivanovii,L.innocua.图 5 PCR-RFLP 电泳图(UnilisA-Lis1B,经三次平行 实验,结果一致)Fig.5 PCR-RFLP rectrictionmapper(UnilisA-Lis1B,Test was repeated three times with the same results)508 食品安全质量检测学报 第 4 卷 实验证明,内切酶 Dde 消化李斯特菌 iap 基因 PCR 产物的方法可以产生特异的酶切谱带,是鉴定李斯特菌种的有效方法。因西尔李斯特菌很少见,本实验室未取得该菌株,所以暂未验证西尔李斯特菌的 PCR-RFLP 实验效果。4 结论结论 本实验以 Bubert 等17所报告的李斯特菌 iap 基因 PCR 方法为基础,发展了检测鉴定李斯特菌种的PCR-RFLP 方法。实验证明,应用引物对“Lis1A-Lis1B”和限制性内切酶 Dde 所建立的 PCR-RFLP方法操作简便,适宜在食品安全检测鉴定工作中推广应用。将该 PCR-RFLP 方法与 PALCAM 琼脂平板分离法相结合可达到快速、准确鉴定多种李斯特菌的目的。参考文献 1 Rocourt J,Cossart P.Listeria monocytogenes in“Food microbi-ology:fundamentals and frontiers”M.Washington,D.C:ASM Press,1997:337352.2 Schuchat A,Swaminathan B,Broome CV.Clinical Epidemiology of human listeriosis J.Microbiol Rev,1991,4(2):169183.3 Vaishali D,Smith T.A Focus on Listeria monocytogenes.United States Department of Agriculture National Agricultural Library(2008).http:/fsrio.nal.usda.gov/document_fsheet.php?product_id=221.4 Cartwright EJ,Jackson KA,Johnson SD,et al.Listeriosis out-breaks and associated food vehicles United States,1998-2008 J.Emerg Infect Dis,2013,19(1):1-9.5 de Castro V,Escudero J,Rodriguez J,et al.Listeriosis outbreak caused by Latin-style fresh cheese,Bizkaia,Spain,August 2012 M.Euro Surveill,2012.6 Guillet C,Join-Lambert O,Le Monnier A,et al.Human listerio-sis caused by Listeria ivanovii J.Emerg Infect Dis,2010,16(1):136-138.7 Milillo SR,Stout JC,Hanning IB,et al.Listeria monocytogenes and hemolytic Listeria innocua in poultry J.Poult Sci,2012,91(9):2158-2163.8 Sauders BD,Overdevest J,Fortes E,et al.Diversity of Listeria species in urban and natural environments J.Appl Environ Mi-crobiol,2012,78(12):4420-4433.9 Rapose A,Lick SD,Ismail N.Listeria grayi bacteremia in a heart transplant recipient J.Transpl Infect Dis,2008,10(6):434-436.10 Mller AA,Schmid MW,Meyer O,et al.Listeria seeligeri iso-lates from food processing environments form two phylogenetic lineages J.Appl Environ Microbiol,2010,76(9):3044-3047.11 Bubert A,Riebe J,Schnitzler N,et al.Isolation of cata-lase-negative Listeria monocytogenes strains from listeriosis pa-tients and their rapid identification by anti-p60 antibodies and/or PCR J.J Clin Microbiol,1997,35(1):179-183.12 Jadhav S,Bhave M,Palombo EA.Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes J.J Microbiol Meth-ods,2012,88(3):327-341.13 Liu D,Lawrence ML,Ainsworth AJ,et al.Species-specific PCR determination of Listeria seeligeri J.Res Microbiol,2004,155(9):741-746.14 Rattanachaikunsopon P,Phumkhachorn P.Identification of viable Listeria species based on reverse transcription-multiplex PCR(RT-MPCR)and restriction digestion J.Biosci Biotechnol Bio-chem,2012,76(6):1189-1194.15 Huang B,Eglezos S,Heron BA,et al.Comparison of multiplex PCR with conventional biochemical methods for the identifica-tion of Listeria spp.isolates from food and clinical samples in Queensland,Australia J.J Food Prot,2007,70(8):1874-1880.16 Liu DLawrence ML,Ainsworth AJ,et al.Isolation and PCR amplification of a species-specific oxidoreductase-coding gene region in Listeria grayi J.Can J Microbiol,2005,51(1):95-98.17 Bubert A,Khler S,Goebel W.The homologous and heterolo-gous regions within the iap gene allow genus-and species-speci-fic identification of Listeria spp.by polymerase chain reaction J.Appl Environ Microbiol,1992,58(8):2625-2632.18 Bubert A,Hein I,Rauch M,et al.Detection and differentiation of Listeria spp.by a single reaction based on multiplex PCR J.Appl Environ Microbiol,1999,65(10):4688-4692.19 Paillard D,Dubois V,Duran R,et al.Rapid identification of Lis-teria species by using restriction fragment length polymorphism of PCR-amplified 23S rRNA gene fragments J.Appl Environ Microbiol,2003,69(11):6386-6392.(责任编辑:赵静)作者简介 郭书林,博士,主要研究方向为动物传染病学。E-mail: 陈信忠,研究员,博士,主要研究方向为动物传染病学。E-mail: