高压脉冲电场辅助溶剂提取蛋黄卵磷脂效果及品质保证.pdf

第 29 卷第 5 期农 业 工 程 学 报Vol.29No.52013 年3 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringMar.2013251高压脉冲电场辅助溶剂提取蛋黄卵磷脂效果及品质保证刘静波，周玉权，刘丹，林松毅，张燕（吉林大学营养与功能食品研究室，长春 130062）摘要：为提高对蛋黄卵磷脂（PC）的提取率，该文利用高压脉冲电场（PEF）辅助有机溶剂来进行提取试验。试验选定了影响 PC 提取率的 3 个主要因素：PEF 场强、脉冲数和提取溶剂含水率，并采用 Box-Behnken 试验设计对提取工艺进行优化；并且，通过中红外光谱扫描分析了经 PEF 处理前后的 PC 分子结构变化。结果表明：PC提取的最佳工艺条件为场强 39 kV/cm，脉冲数 31，提取溶剂含水率 9%，其 PC 提取率比无 PEF 处理的传统有机溶剂提取法提高了 10.2%；PEF 对 PC 分子结构并没有显著影响，证实了 PEF 对食品营养成分破坏少，是一种温和的处理方式。该研究可为 PEF 技术应用于蛋黄卵磷脂的提取提供参考。关键词：高压脉冲电场，高效液相色谱，傅立叶变换红外光谱，提取，卵磷脂，响应面doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.05.033中图分类号：TS253.1文献标志码：A文章编号：1002-6819(2013)-05-0251-08刘静波，周玉权，刘丹，等.高压脉冲电场辅助溶剂提取蛋黄卵磷脂效果及品质保证J.农业工程学报，2013，29(5)：251258.Liu Jingbo,Zhou Yuquan,Liu Dan,et al.Extracting egg yolk lecithin using PEF-assisted organic solventJ.Transactionsof the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(5):251258.(in Chinese withEnglish abstract)0引言鸡 蛋 的 蛋 黄 中 含 有 丰 富 的 蛋 黄 卵 磷 脂（phosphatidylcholine,PC），其磷脂酰胆碱的含量比大豆卵磷脂高 3 倍左右1，并且纯度高，氧化稳定性好，有关研究表明在生物亲和性和增强记忆等方面明显优于植物来源的卵磷脂。但目前国内对蛋黄卵磷脂的研究较少，工业化生产水平低，所以，生产出蛋黄卵磷脂这种高附加值产品，使其产生更大的经济效益和社会效益，已经成为中国食品加工领域一项亟需解决的课题。加强蛋黄卵磷脂提取技术的研究对加快蛋黄卵磷脂的工业化生产进程具有重要的意义。高压脉冲电场技术high-voltage pulsed electric fields，PEF）是一种非热处理技术，其工作原理是对两电极间的流态食品反复施加高电压的短脉冲作用（典型为2080 kV/cm）。由于 PEF 技术具有操作条件温和、处理时间短、参数易控制、可连续性操作、对食品收稿日期：2012-10-09修订日期：2013-02-22项目基金：“十二五”国家科技支撑计划课题“蛋制品加工技术研发与产业化示范”（2012BAD28B08）。作者简介：刘静波（1962），女，教授，博士，研究方向：营养与功能食品。长春吉林大学营养与功能食品研究室，130062。Email:通信作者：林松毅（1970），女教授，博士，研究方向：营养与功能食品。长春吉林大学营养与功能食品研究室，130062。Email:营养成分破坏少等特点2，非常适合于食品杀菌、灭酶和天然活性物质的提取，成为近年来国内外加工领域研究的新热点。张燕等3利用 PEF 提取了红莓花色苷，发现通过 PEF 预处理可以提高花色苷的提取率，并缩短了提取时间。Ana 等4用 PEF 处理橙汁乳饮料，与巴式杀菌比较来考察 PEF 对类胡萝卜素的影响及其贮藏中的变化，结果表明 PEF 可以显著保留类胡萝卜素的含量，并且也能在贮藏过程中较好地维持其维 A 原活性。梁琦等5考察了 PEF对油酸的影响，结果表明PEF 处理过的油酸的色泽与酸价无显著变化，但过氧化值随着PEF 处理强度和贮藏时间的增加显著增大。B.Laura 等6用能量输入 2.3J/mL、场强 31.5 1.0 kV/cm、频率 1 Hz 和脉冲数200 的 PEF 条件对缓冲溶液中的卵清蛋白进行处理，发现卵清蛋白分子会发生部分结构改变，巯基发生电离现象，但 PEF 处理不会对蛋白质结构产生显著影响。M.Dolores 等7研究表明：在保持样品温度 29以下，特定的 PEF 条件不仅能使卵清蛋白分子部分结构展开，而且也提高了 SH 基团的电离化，生成了高活性的 S-，并且脉冲数和输入能量显著影响 SH 基团的反应活性。Y.Li 等8研究了PEF 对大豆分离蛋白结构与功能性质的影响，结果表明随着脉冲强度和脉冲处理时间的延长，大豆分离蛋白的溶解度、乳化性、起泡性及疏水性增加，当脉冲强度或处理时间大于一定程度，蛋农业工程学报2013 年252白质分子变性程度增加，功能性质下降。陈玉江等9研究了 PEF 场强、脉冲数和助剂浓度对 PC提取效果的影响，得到提取的最优工艺参数。但在试验条件、工艺优化方案以及结果分析等方面均存在不足，试验结果可能会有一定偏差。本文利用 PEF 辅助有机溶剂的方法来提取蛋黄卵磷脂。经过初步研究，选定 PEF 场强、脉冲数、提取溶剂含水率 3 个主要因素，考察其对 PC 提取率的影响。利用 Box-Behnken 优化出最佳提取工艺参数，并且通过扫描 FTIR（Fourier transform infraredspectroscopy）图谱来对比 PEF 辅助处理前后 PC 结构的变化，为 PEF 技术应用于蛋黄卵磷脂的提取提供相关参考。1试验材料与方法1.11.1材料与仪器新鲜蛋黄粉，吉林省金翼蛋品有限公司；无水乙醇；丙酮；PC 标准品 P3556-100 mg，美国 SIGMA公司；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），美国 FisherScientific 公司。高压脉冲电场提取装置 LDT-200，专利产品10；岛津 LC-2010A 高效液相分析仪；Agilent ZOBAXRX-SIL（4.6 mm 250 mm 5 m）分析型硅胶柱；DZF-6050 型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司；岛津 IRPrestige-21 型傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）；岛津 UV-2550 紫外分光光度仪。1.21.2试验方法1.2.1蛋黄粉的预处理将新鲜蛋黄粉过筛（140 目），加入丙酮搅拌15 min 后，在 20条件下静置 2 h 以脱除中性油脂及游离脂肪酸，浸提后抽滤11。将滤饼再用丙酮溶解，浸提后抽滤，直至抽滤出来的丙酮为无色。将含有磷脂的滤饼置于 30的真空干燥箱中烘干90 min，以去除残留丙酮，使之成为干燥的丙酮不溶物粉末。1.2.2传统有机溶剂提取法考察传统有机溶剂提取法对 PC 的最佳提取效果。按照黄金枝等12的试验研究确定 PC 提取最佳工艺条件与方法设置试验，检测其 PC 提取效果，以作为参照与对比。1.2.3PEF 辅助有机溶剂提取法在室温条件下，干燥不溶物粉末与提取溶剂（不同含水率的乙醇溶液）以 110 的料液比混匀。调试高压脉冲处理装置，选用方形波，脉宽 2 s，使高压脉冲电源产生的脉冲作用于处理室内的电极，从而对以适宜速度（0.2 mL/s）流经 PEF 处理室的料液进行处理。考察电场场强、脉冲数以及提取溶剂含水率 3 个因素对 PC 提取率的影响，每个因素设置 5 个水平，如下所示：1）电场场强 E：10、20、30、40、50 kV/cm；2）脉冲数 C：0、10、20、30、40；3）含水率：0、5%、10%、15%、20%对于每组试验样品，同时测定和计算其 PEF 处理前后的温度变化，即实际温升值（Ts）。电场场强 E 与脉冲数 C 等参数均有相关的换算公式13：2p pvEl（1）2r lfCq（2）式中，vp.p为示波器中显示的电压值，kV；l 为处理室内电极间的长度，值为 0.15 cm；r 为处理室进料孔半径，值为 0.05 cm；f 为频率，Hz；q 为物料流速，值为 0.2 mL/s。PEF 处理室是 PEF 提取装置的主要部件14。如图 1 所示，PEF 处理室容量 V=6 cm 5 cm 0.3 cm，空间较小。在电场产生区域均匀排列若干进料孔，料液经过进料孔接受脉冲电场的作用。PEF 电极板间产生的瞬时电脉冲电压很高，vp.p达 1 kV 以上，在狭小的电场产生区域中会产生很强的脉冲电场，因此该区域中的不同点的场强的差异是极其微小的。可以认为，电脉冲通过电极板在电场产生区域中形成的是匀强电场。料液实际受到的场强就等于匀强电场场强(E)。1.电场 Electric field2.绝缘材料 Electric insulation3.进料孔 Feed opening4.电极板 Electrode plate图 1PEF 处理室结构图Fig.1Structure chart of PEF treatment chamber1.2.4HPLC 测定 PC 含量参照相关文献15-16，经反复试验最终确定HPLC 色谱条件为：色谱柱采用 Zorbax RX-SIL（4.6 mm250 mm4 m）正相硅胶柱；流动相：甲醇乙腈水=70255，水中加入 0.1%的乙酸可改善峰形；梯度洗脱，流速：0.7 mL/min；柱温：35；检测波长：204 nm；进样量：10 L。将样品溶液用无水乙醇稀释 5 倍，之后用0.25 m 有机膜过滤，按以上色谱条件对各样品进行 PC 含量的测定。第 5 期刘静波等：高压脉冲电场辅助溶剂提取蛋黄卵磷脂效果及品质保证2531.2.5PC 含量标准工作曲线的绘制精密称取 PC 标准品 10 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加无水乙醇，溶解并稀释至刻度，得 1 mg/mL的对照品溶液。在紫外分光光度仪下将对照品溶液进行波谱扫描，记录其特征峰值，为 204 nm。按照1.2.3 中规定的液相条件下分别以 2、4、6、8、10、12 L 的标准品溶液进样。以紫外检测器的电信号峰的峰面积为横坐标，进样量为纵坐标绘制 PC 标准工作曲线。1.2.6响应面（Box-Behnken）试验设计以 PEF 电场场强、脉冲数、提取溶剂含水率作为影响 PC 提取率的主要因素。将这 3 个因素分别作为自变量 X1、X2、X3，每个因素设置 3 个水平，以 1、0、+1 进行水平编码17。PC 提取率的响应值如式（1）所示120111kikkkiiiiijiiijiij iYXXX X （3）式中，Yi为 PC 提取率对应的峰面积；0，i，ii及 ij分别为方程的一次项，二次项及交互项系数；Xi、Xj为因素自变量，k 为因素水平数。经过单因素试验选取自变量取值范围，因素水平编码如表 1 所示。据此进行中心组合试验设计，每组试验重复 3 次，其结果求平均值得出。并采用Design-Expert 软件进行回归模型分析。表 1因素水平编码表Table 1Factors and levels of experimental design水平编号Level number因素Factor编码Code-101场强/(kV cm-1)Field strength/(kV cm-1)X1304050脉冲数Pulse numbersX2203040含水率/%Moisture content/%X3510151.2.7FTIR 分析结构变化将红外扫描波段调制为 4 0001 000 cm-1，对在优化的 PEF 参数条件下处理的样品进行结构扫描，并且设置空白对照，然后对 FTIR 图谱进行处理和比较，分析结构变化。2试验结果与分析2.1PC 标准工作曲线的测定如图 2 所示，PC 含量与峰面积的标准工作曲线的回归方程为 Y=1.1666X 0.0382，相关系数R2=0.9999，说明溶液中 PC 含量与信号峰的峰面积呈正相关，具有良好的线性关系。那么，用峰面积值的大小来表示 PC 提取率的高低是可行的。图 2PC 含量与峰面积的标准工作曲线Fig.2Standard working curve of PC content and peak area2.2Box-Behnken 中心组合设计与结果设计了 17 个试验点的响应面分析试验，其中12 个析因点，包含 5 个零点试验以分析误差。试验方案与结果如表 2 所示。表 2中心组合试验设计及响应值Table 2Experimental design and results of centralcomposition design自变量编码值Argument code value模型响应值Response value试验序号ExperimentalnumberX1X2X3实际值Actual value预测值Predictedvalue1-1-101.8501.85121-101.8471.8443-1101.8561.86041101.8481.8465-10-11.8511.855610-11.8471.8457-1011.8461.84581011.8351.83390-1-11.8571.8591001-11.8591.861110-111.8491.841120111.8521.859130001.8811.881140001.8841.881150001.8811.881160001.8791.881170001.8831.8812.3二次回归模型建立与方差分析通过对 17 组试验的结果进行分析，对试验数据进行多项式回归分析，建立二次响应回归模型，拟合得到二次回归方程，如式 4 所示，并对回归方程进行方差分析，如表 3 所示。Y=1.88 0.00325X1+0.0015X2 0.004X30.00125X1X2 0.00175X1X3+0.00025X2X30.02X12 0.011X22 0.016X32（4）农业工程学报2013 年254上述二次回归模型方程的回归系数R2=0.9955，从回归模型的方差分析结果可以看出，所建立的模型能很好地反映试验数据，回归方程的拟合度较好，试验误差小。基于回归方程的因素显著性分析，在显著水平为 p0.01 条件下，模型中的一次项电场场强 X1（p=0.0007）、提取溶剂含水率 X3（p=0.0002）、二次项 X12、X22和 X32均表现极显著；在显 著水平 为 p 0.05 条 件下，脉 冲 数 X2（p=0.0339）、交互项 X1X3表现显著；其他则表现不显著。模型的失拟项 p=0.84920.05，表明失拟不显著，即该模型是稳定的，能较好地预测在实际不同因素组合处理后 PC 提取率的变化情况。因此，可以采用此模型对 PC 提取率进行分析和预测。表 3回归模型的方差分析Table 3Analysis of variance of the regression model变异来源Source ofvariation平方和Sumsquares/(10-5)自由度Degree offreedom均方Meansquare/(10-5)F 值F-valueP 值P-value显著性Significance模型Model401944.6171.430.0001*X18.4518.4532.500.0007*X21.811.86.920.0339*X312.8112.849.230.0002*X1X20.62510.6252.400.1650X1X31.2311.234.710.0327*X2X30.02510.0250.0960.7655X121761176675.600.0001*X2250.3150.3193.290.0001*X321141114436.890.0001*残差Residual1.8270.26失拟Lack of fit0.330.10.260.8492纯误差Pure error1.5240.38总和Sum40316注：*极显著水平(P0.01)；*显著水平(P0.05)Note:*means highly significant level(P0.01),*means significant level(P0.05)2.4响应面分析基于二次回归模型绘制 3 个因素的等高线图与三维曲面图（如图 3）。通过对比发现，对 PC 提取率的影响强弱依次为：场强含水率脉冲数。2.4.1PEF 场强与脉冲数对 PC 提取率的影响从图 3a 可看出，在提取溶剂含水率不变的情况下，PC 提取率随场强增加而快速上升。在场强达到40 kV/cm 以后，提取率反而出现快速下降趋势，这极有可能是因为较强的场强对 PC 的结构产生了一定的影响，使其结构发生变化，提取率下降18-19。此a.PEF 场强与脉冲数对 PC 提取率的影响a.Effect of field strength and pulse numbers on PC extractionb.PEF 场强与提取溶剂含水率对 PC 提取率的影响b.Effect of field strength and moisture content of extraction solvent on PCextractionc.PEF 脉冲数与提取溶剂含水率对 PC 提取率的影响c.Effect of pulse numbers and moisture content of extraction solvent on PCextraction注：X1 为场强因素；X2 为脉冲数因素；X3 为含水率因素。Note:X1 isfield strength factor；X2 is pulse numbers factor；X3 ismoisture content factor.图 3不同因素等高线图与三维曲面图Fig.3Contour maps and 3D surface charts of different factors第 5 期刘静波等：高压脉冲电场辅助溶剂提取蛋黄卵磷脂效果及品质保证255外，脉冲数大小反映了 PEF 作用时间长短，在脉冲数小于 30 时，PC 提取率随脉冲数增加而呈较缓趋势升高，之后呈下降趋势。这说明 PEF 对料液的作用短时间内有助于 PC 的提取，而作用时间太长可能会造成 PC 活性物质的降解或性质的改变20-21，提取率反而降低。2.4.2PEF 场强与提取溶剂含水率对 PC 提取率的影响由图 3b 中可看出，场强与提取溶剂含水率交互作用较明显。在实际试验中发现：用纯乙醇（含水率为 0）作为溶剂，在适当范围内，无论场强与脉冲数怎样变化，对 PC 提取率几乎没有任何影响。而当乙醇具有一定的含水率并且发生变化时，PC 提取率则产生显著变化。这可能与纯乙醇和水的导电性质以及在 PEF 作用下产生的电化学反应有关22。由于纯乙醇绝缘能力强，较低的场强对纯乙醇溶剂的作用效果不明显，但较大的场强（E60 kV/cm）会使提取溶剂的绝缘能力变弱产生火花和其他不利影响23；而水具有一定的导电性，只有乙醇与水以适当比例混合，即提取溶剂具有一定的含水率时，PEF 即使在较低场强作用下也能很好的作用于提取液。正如图中显示，溶剂含水率也不能过高，当含水率达到 10%左右以后，PC 提取率反而呈下降趋势。这主要是由于含水率过高影响了有机溶剂本身对 PC 的提取效果。当场强为 41 kV/cm，脉冲数为 30，提取溶剂含水率为 9.4%时，峰面积达到区间最大值。2.4.3PEF 脉冲数与提取溶剂含水率对 PC 提取率的影响由图 3c 中可看出，固定 PEF 场强为 40 kV/cm，当提取溶剂含水率较低时，PC 提取率随含水率升高而急剧上升，当含水率达到 10%左右以后则呈较缓下降趋势。峰面积最大值点落在脉冲数为 30 所对应的曲线上。当场强为 40 kV/cm，脉冲数为 30，提取溶剂含水率为 10.1%时，峰面积达到区间最大值。2.5最优因素组合的确定与验证依据响应面分析结果，通过软件 Design-Expert求解二次回归方程，得出影响 PC 提取率的最优因素组合为：场强 39 kV/cm，脉冲数 31，提取溶剂含水率 9%，代入方程所得峰面积值为 1.882。依照此优化条件进行验证试验，重复 3 次，峰面积值分别为 1.883、1.880、1.882，平均值为 1.8825。试验值与模型优化模拟值基本一致，这说明模型可靠性较高，能较好地预测实际情况。传统有机溶剂法提取的 PC 含量的检测峰面积值的平均值为 1.712。2.6PEF 处理中的温度变化对 PC 提取率的影响考察 PEF 对 PC 提取率的影响是否与处理室内温度的升高有关。根据相关文献23-24，可以得出以下计算公式：2224p pvCl ECQRVRV（5）TQ（6）由此得出式（7）。2ECTV（7）式中，Q 为能量密度，J/mL；T 为处理室理论温升，；为脉宽，s；V 为处理室容量，mL；R为有效电阻，。所以，理论上处理室内温度的升高与场强的 2 次方、脉宽、脉冲数成正比。由此可见，场强产生的温升效应高于脉宽与脉冲数。在初始温度为室温条件下（T0=25），料液在不同参数条件的PEF处理下实际的温度变化情况如图4所示。图 4场强的变化对料液温升值的影响Fig.4Effect of field strength on value of temperature rise ofmaterial liquid图 4 中显示，料液的温度升高（Ts）情况与式（6）具有大致的相关性，即 Ts随场强与脉冲数的增大而升高，脉宽过宽也易导致 Ts的升高。但由于受诸多因素（如料液密度、料液性质、能量损失等）的综合影响，Ts并没有达到预期的变化程度。通过测定与计算各组料液的 Ts值得出：Ts处于 08.4的范围内，即在 PEF 处理中料液的温度最高可从 T0上升至 33.4。而在此温度范围内通过考察传统乙醇提取法的 PC 提取效果发现：溶液的 PC 含量处于（0.192 0.001）mg/mL 之间。这说明 PEF 处理中的温度变化对 PC 提取效果具有一定的影响，但由于温度变化不大，对 PC 提取率的影响远小于电场场强与脉冲数的作用。这也说明了PEF 处理是一种温和的处理方式。同时也应注意的是，低场强、短脉宽可以有效地降低处理室的温度变化。农业工程学报2013 年2562.7FTIR 测定结构变化绝大多数有机化合物的基频振动出现在4 0001 000 cm-1的中红外区。PC 分子的主要官能团为磷酸键与羧基。这些基团容易受到 PEF 的强电离作用而被破坏，或者发生水解作用。从图 5 中可看出，PEF 对 PC 分子的强电离作用并没有对包括主要官能团在内的基团以及键合情况造成明显的影响。不过，1 234 cm-1处的P=O 伸缩振动与1 734 cm-1处的C=O伸缩振动有较小程度的减弱。N H与O H的伸缩振动（处于 3 2003 500 cm-1之间）也有一定程度的减弱。总体来说，PEF 处理对 PC 分子结构影响不大。注：a 为未处理；b 为处理后Note:a is untreated.b is treated.图 5PEF 处理前后 PC 的 FTIR 光谱图对比Fig.5FTIR spectra of PC before and after PEF treatment3结论本文利用 PEF 辅助有机溶剂来提取蛋黄卵磷脂。基于 Box-Behnken 优化设计试验确定了影响 PC提取率的主要因素为 PEF 电场场强与提取溶剂含水率，而 PEF 脉冲数为次要因素，而且也优化出了因素最佳组合：场强为 39 kV/cm，脉冲数为 31，提取溶剂含水率为 9%，所得的峰面积值为 1.882。依据 PC 含量标准工作曲线公式计算所得的 PC 含量为 0.216 mg/mL；传统有机溶剂提取法的峰面积值为 1.712，相应的 PC 含量为 0.196 mg/mL。前者较之于后者的 PC 提取率提高了 10.2%。并且 PEF处理过程中的温升效应会造成料液温度较小程度的升高，但对 PC 提取率的影响远小于电场场强与脉冲数的作用。通过 FTIR 分析经 PEF 处理前后的 PC 分子结构变化发现：虽然 PEF 的作用提高了 PC 提取率，但它的强电作用并没有对 PC 分子的官能团等基团以及键合情况造成明显的影响。这反映了 PEF 处理对食品营养成分的破坏少，是一种温和的、较理想的处理方式。参考文献1朱志伟.第三营养素 卵磷脂J.大学化学，2010，25(4)：7780.Zhu Zhiwei.The third nutrient:phosphatidylcholineJ.College Chemistry,2010,25(4):7780.(in Chinesewith English abstract)2Qian Sui,Hubert Roginski.Effect of pulsed electric fieldand thermal treatment on the physicochemical andfunctionalpropertiesofwheyproteinisolateJ.International Dairy Journal,2011,21(4):206213.3张燕，李玉杰，胡小松，等.高压脉冲电场(PEF)处理对红莓花色苷提取过程的影响J.食品与发酵工业，2006，32(6)：129132.Zhang Ye,Li Yujie,Hu Xiaosong,et al.Effect of PEF onextraction process of anthocyanin in red 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