BJS201707植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定.doc

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植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定
BJS 201707

1 范围
本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。
本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。
2 原理
提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。
3试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无
DNA酶污染的容器分装。
3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为：
核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’
核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’
核桃探针：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’
3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物（对）序列为：
花生5’端引物:5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’
花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’
花生探针：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’
3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为：
杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’
杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’
杏仁探针：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’
3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为：
芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’
芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’
芝麻探针：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’
3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为：
榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’
榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’
榛子探针：5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’
3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为：
大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
大豆探针：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’
3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为：
内参照5’端引物: 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’
内参照3’端引物: 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’
内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’
3.8 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，
用10%盐酸调节pH 至8.0，121℃高压灭菌20 min, 备用。
3.9 蛋白酶K：20mg/mL。
3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。
3.11 异丙醇。
3.12 70%乙醇。
3.13 Taq DNA聚合酶。
3.14 dNTP混合液。
3.15 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
3.16 10×PCR缓冲液：200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）。
4仪器和设备
4.1 组织研磨器。
4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
4.3 恒温水浴锅。
4.4 离心机：离心力12,000g。
4.5 微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL）。
4.6 实时荧光PCR仪。
4.7 涡旋振荡器。
4.8 天平：感量0.01g。
5分析步骤
5.1 试样总DNA的提取
固体样品：将样品粉碎后称取0.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。
液体样品：取1 mL 样品于Eppordorf管中，加入1 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5 min，室温下以12,500 rpm 离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。
（1）将处理后的样品加入2 mL离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K溶液，振荡混匀，65℃孵育1 h（过夜孵育更好）, 期间每隔10 min振荡混匀；
（2）加入500 μL的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），振荡抽提10 min，室温下以12,500 rpm 离心10 min；
（3）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500 rpm 离心10 min；
（4）弃去上清液，用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA；
（5）小心吸取上清，加入200 μL氯仿：异戊醇（24:1），振荡抽提，室温下以12500 rpm 离心15 min；
（6）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500rpm 离心10 min；
（7）弃去上清液，沉淀用70% 乙醇洗涤，离心1min，晾干，溶于50μLTE 缓冲液中。
5.2 DNA浓度和纯度的测定
取1μL DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。
5.3 实时荧光PCR扩增
反应体系总体积为25μL，其中10×PCR缓冲液5μL，正反向引物（10μmol/L）各1μL，探针（10μmol/L）1μL，dNTPs（10μmol/L）2μL ，Taq DNA聚合酶（2.5U）0.2 μL，DNA模板（10-100ng/μL）2μL，用灭菌去离子水补足至总体积25μL。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。
反应参数：50℃ 2min； 95℃ 15min； 95℃ 15s， 60℃ 1min， 40个循环。
5.4 实验对照
检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。
6结果判断与表述
6.1 质量控制
以下条件有一条不满足时，结果视为无效：
(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；
(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；
(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；
(d)内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。
6.2 结果判定
(a)如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性；
(b)如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性；
(c)如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定被检样品可疑。
6.3 结果表述
结果为阳性者，结合产品标识，表述为“检出XX源性成分”。
结果为阴性者，结合产品标识，表述为“未检出XX源性成分”。
结果为可疑者，结合产品标识，表述为“XX源性成分可疑”。
7防污染措施
检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。

本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院。
验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。
主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。

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