细胞常见污染情况分析.doc

仅供个人参考
细胞培养常见污染的判别及应对措施
2011-01-02 10:19:04| 分类： 实验 | 标签：污染 无菌 细胞 培养基 灭菌 |字号大中小 订阅
一、避免细胞培养污染的措施：
污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免 的：
1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！
2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：
下面是几种细胞培养过程中常见的污染：
1. 支原体污染：
传说中的黑焦虫，长得暴快。24小时就满视野都是了。污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）
图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）
图3 支原体污染的荧光检测
图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）
图5 支原体污染的电镜检测
2. 念珠菌污染：
似乎无处不在，而且顽固得很。长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。培养液澄清。低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）
图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）
图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）
图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）
这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。既然已经污染了，就全部更换你的器皿。培养箱的水没有必要用无菌水，但最起码要是蒸馏水。
3.霉菌污染
比较常见的一种污染，常常来源于污染的空气、水和器械。
图10 霉菌污染的光镜检测（低倍）
图11 霉菌污染的光镜检测
（典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。400倍）
图12 霉菌污染的光镜检测（树枝状，高倍）
图13 霉菌污染的倒置显微镜检测（树枝状）
4. 杆菌污染：
培养基中加入抗生素可以减少此种污染，但也不是绝对的。
图14 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，高倍）
图15 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，低倍）
细胞中的颗粒到底是怎么回事？
我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。好像是细胞碎片一样。是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!
我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么
是黑色的小碎片。我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。但是，是什么东西不清楚。
的确很常见
在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。
以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？
我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。
我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长
我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染
最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了
细胞培养的细菌污染
我们新建的细胞室。每周都会做清洁，用0。2%新洁尔灭消毒，照紫外。实验前也会照至少30分钟。培养基中加青霉素，链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！
很可能是超净台无效了，，或者培养基？ 其实严格操作箱污染都难
我们是新的超净台，不可能失效。而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一瓶污染，
新传的很好。所以我分析不出原因呀
那么假如把原始的那瓶换新瓶养可以么？
都污染了，我仍还来不及，那还敢换新瓶
染菌有很多原因，因为整个细胞操作过程均要求无菌，所以看看操作是否规范，例如戴手套等。
多半是环境因素，做点平板，操作时放在几个地方，培养后看看长菌情况。消毒用新洁尔灭好象不是太有用。
人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩没有，其实，只要你操作的好，严格在靠近火的附近操作，污染的几率是很小的。从你的描述中可以看出培养基应该没有问题，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不当引起的，还需要加强练手。
求助！关于细胞培养中的真菌污染！感激！
先谢谢大家的帮助！现在细胞培养基里出现了很多白色和黑色的小点，有好长的时间了！细胞的形态看起来不太好，但是有些细胞也长的很好，如成纤维细胞，但是内皮细胞就差很多！加大量的抗生素没有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鉴别！因为培养了很长时间都没有出现真菌的菌丝，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圆点有点象白色链球菌或链珠菌，但是不能确定！怎么样才能判断确定，改用什么办法解决！谢谢大家的帮助！
杀灭真菌听说用两性霉素，但从没试过。真菌污染是件很麻烦的事，可能重新复苏细胞是最好的办法。同时该注意如何防止污染。
我觉得如果是真菌污染，培养基会浑浊，是肉眼可见的浑浊。在这种情况下最好赶紧将该瓶细胞扔掉，免得引起培养箱中的大规摸污染。在显微镜下，真菌是成念珠状的，这时细胞界限不清。这可能是不规范操作引起的，安全起见还是将细胞室全面打扫一下，用新洁尔灭擦，紫外照！
谢谢大家的帮助，因为实验室以前从来就没有这样的污染，所以大家也没有经验！现在就是不能确定是不是污染。我不可能把实验室所有的细胞都扔掉，因为有好多人都在一起养不同类型的细胞！现在确实是问题，培养基也没有浑浊，操作的时候已经十二分的小心了！
我想问一下，你看到的那些白色或黑色的圆点是在低倍还是高倍显微镜下？若培养基不混浊，可能真的是细胞状态太差，没有贴壁还缩成球状。难道你们实验室所有细胞都用一瓶培养基？只要将污染的扔掉就行，没必要都扔掉！
两性霉素！sigma在华美有分装！但是浓度很小，关键还是环境问题！
黑白圆点在100倍显微镜下有多大，是不是酵母菌
小黑点和小白点是在200倍的显微镜下观察所见，大小可能是细胞核的1/5到1/4左右！细胞状态不好是因为跟以前培养的细胞来比较所得，细胞能贴壁，能生长，但是没有以前的那么快，而且形态看的也不好！另外问一下sleevexz，酵母菌是什么样的，怎么鉴别！
还有一个问题就是，实验室用的双抗是从Gibco公司买过来的直接使用的液体，具体规格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin 一起，50倍的，要求储存在－20 C，但是有效期只到2002年9月，现在都已经差不多过期半年了，但是实验室的老师都说没有问题，可以用，现在大家就都是一直用这样的抗生素在！你们说会不会是抗生素的问题的！
养细胞经常无缘无辜的染菌？烦烦烦！！！！我是一个新手，但已养细胞近半年，最近一段时间经常染菌，有时是培养基，有时连原因都找不到，在实验中我也非常小心，但结果总让我伤心。现在都有点神经质了，请各位指点
你这个问题说大不大，说小也不小。说不大呢，七个字就可以回答你：严格按照无菌要求。说不小呢，这无菌要求的话匣子一打开太大。还是简要吧：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。
一下也想不了那么多，具体的你再问吧。最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了。建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。还有，你们的紫外灯没有问题吧？
非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。我一般是这样操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指点。
戴手套试试巴
最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。
你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是否正确。还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！
从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。你用的吸管是自己做的吗？经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。
操作是导致污染的最主要原因
根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。
本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40分钟后才允许进入。但是，就是这样的条件，操作不好，一样要污染。
现在本人工作的实验室要求比那个实验室差的天远地远，但是只要操作仔细了，一样可以把最难养的细胞养好。本人曾经参观过一些名人进行细胞操作，也就是换上拖鞋，连工作服都不换就进细胞室，细胞一样没有问题。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。如果不能保证，不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。操作时，滴管两头都要烧。还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。在倒培养液的时候，可以拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。还有一些基本的问题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。如果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（医院里给病人加药后的药瓶，用无菌盐水涮涮就能用，浓度足够），但要小心浓度太高细胞也会死亡。
对付霉菌通常用饱和的硫酸铜溶液，放在培养箱的装水盘中，细胞房的空调要用除湿的功能。如果不幸染上，要用84液擦培养箱，再用75%酒精擦。
灭菌操作：
在无菌箱内每立方米用甲醛8—10毫升，高锰酸钾5克，熏蒸45分钟后接种
在无菌箱中每立方米用甲醛8－10毫升、高锰酸钾0.25千克，熏蒸45分钟后接种，栽培种接种量按每瓶二级种接30－40袋为宜。
（一）常用消毒剂
　　 现将常用的消毒药品及其配制、使用方法，介绍如下：
1． 35％甲醛水溶液（HCHO）：又名福尔马林，使蛋白质变性。用于培养室、无菌室的灭菌。
　　 2．0.1％的升汞水（HgCL3）：能使蛋白质变性，抑制酶类。0.1％升汞配制方法是称取升汞0.1克， 用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于无菌箱、培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。
　　 3．石炭酸（C6H5OH），5％浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成用于 工作服、实验桌的灭菌。杀菌效果同升汞。
　　 4．高锰酸钾（KMnO4）：氧化剂。0.1％浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或杀死 杂菌。
　　 5．乙醇（CH3CH3OH）：又称酒精。消毒以75％浓度的效果最好。它能使蛋白质脱水变性。高浓度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。
　　 6．新洁尔灭：0.25％新洁尔灭用于无菌箱、无菌室的灭菌。一般新洁尔灭5％原液50毫升；加水950毫升配成。
　　 7．漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前临时配制，静置1～2小时，取上清液喷射，进 行室内消毒，每平方米用1升。
　　 8．药皂：煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。
　　 9．2％硫酸铜溶液：用硫酸铜（胆矾）2克，加水至 100毫升加热溶解配成。用于床架、木架等各种菌种架的消 毒。还可用5％硫酸铜溶液。
　　 10．0.5％波尔多液：先用硫酸铜1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起来即成。用于菌种架、段木的消毒。
　　 11.多菌灵：用于杀灭真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍喷洒均可。
　　 （二）无菌箱及无菌室的消毒灭菌
　　 无菌箱的消毒灭菌，可采取以下几种方法：
　　 l．用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房门，熏蒸20—30分钟即可。
　　 2．0.1％升汞水消毒：用0.1％升汞水浸过的纱布或海绵进行指擦，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起来。喷雾后 20～30分钟，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。
　　 3．紫外线照射灭菌：在无菌箱中装一支200伏、3O瓦的紫外线灯管；每次开20～30分钟，就能达到空间杀菌的 目的。照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。
　　 4．石炭酸喷雾：在每次接种之前，用5％石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。
　　 5．石灰揩擦：经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍。实践证明，这样做效果很好。
无菌室消毒同无菌箱。
　　 （三）无菌室的使用规程
　　 无菌室无固定程序，但按一般操作应遵循如下规程：
　　 1．接种室内和缓冲室内使用前，用5％石炭酸溶液喷雾。把所需要的器材搬入缓冲室清洗，等晒干后搬入接种 室，打开紫外线灯，照射杀菌。
　　 2．穿上工作服及无菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分钟。进人接种室后，查验器械是否放在一定位置。然后用 5％石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。然后退回缓冲室。还可给接种室门口地面洒一层石灰，进门时踩石灰可使鞋底保持无杂菌状态。
　　 3．接种操作前，用70％的酒精棉球擦手。进行无菌操作时，要严格认真，动作轻捷，尽量减少空气流动。
　　 4．工作结束后，立即将台面收拾干净，不留残物。然后用5％石炭酸全面喷洒。
　　 5．操作时，注意安全。如棉塞着火，用手紧握即可熄灭。如打破菌瓶，可用抹布沾5％石炭酸，收拾到废物桶 内。每次的污染物应小心放在盘内，盖严拿出室外深埋或烧掉。
　　 （四）无菌室空气污染情况的检验
　　 定期检验无菌室空气污染情况，对改进灭菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步骤如下：
　　 1．平板检验法：用常规培养基，倒成平板，收入接种室。在事先熏蒸好的接种室，使用前半小时或1小时把供试的培养皿或试管打开，按预定时间盖好培养皿或试管。留对照皿不打开。然后一起放入30℃的温箱中培养48小时，检查有无菌殖生长，并由菌落形态，判断杂菌种类。一般要求平板培养基开盖5分钟，菌落不超过3个；叙面培养基开塞 30分钟者，以不出现菌落为合格。
　　 2．斜面检验法：将常用的琼脂斜面培养基各取二管， 放入接种室，按无菌操作各将其中的一管的棉塞取出，放在灭菌的培养皿内。经过一定时间后，再将棉塞通过火焰，塞回试管连同对照一起培养。经48小时后，检验无杂菌生长。和上边方法同。
　　 3．空气污染情况检验：在接种过程中，人员的出过、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成空气污染，检验方法是在准备工作结束后，接种操作开始时，按上述方法打开培养皿盖子或试管塞，经5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内，空气污染的程度。
　　 如霉菌较多时；可先用5％石炭酸全面喷射后，再用甲醛熏蒸。如细菌较多时，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的办法加以杀灭。

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