第二十二章免疫学检测技术的基本原理.doc

第二十二章 免疫学检测技术的基本原理第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素（一）抗原抗体反应特点1高度特异性 抗原与抗体的结合具有高度特异性，这种特异性是由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定的。空间构型互补程度越高，抗原表位与抗体可变（V）区之间结合力越强，抗原抗体结合的特异性越强，亲和力也越高。利用这一特点，在体外可以对许多未知的生物学物质进行特异性鉴定。如利用抗伤寒杆菌的抗体检测伤寒杆菌；也可用已知的抗原（如乙型肝炎病毒）来检测相应的抗体（抗乙型肝炎病毒抗体）。2表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特性。解离度主要取决于两个方面：一是抗体与抗原结合的亲和力（affinity）。亲和力指抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位之间互补结合的强度。抗体亲和力越高，解离度越低；反之抗体的亲和力越低，解离度越高。二是抗原抗体反应的环境因素如温度、酸碱度和离子强度。因此在体外进行抗原抗体反应时，要求适当的温度、酸碱度和离子强度等条件。3适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于两者适当的浓度和比例。在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度和比例适当则抗原抗体复合物体积大、数量多，出现肉眼可见的反应。若抗原或抗体过剩，抗原-抗体复合物体积小、数量少，不能出现肉眼可见的反应。故在具体实验过程中要适当稀释抗原或抗体，以调整两者浓度和比例，使其出现最大复合物，避免假阴性的发生。4抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一个阶段是抗原抗体特异性结合阶段。抗原分子与抗体分子之间是互补的非共价结合，该反应迅速，可在数秒钟至几分钟内完成，一般不出现肉眼可见的反应。第二阶段为可见反应阶段，是小的抗原抗体复合物之间靠正、负电荷吸引形成较大复合物的过程。此阶段所需时间从数分、数小时至数日不等，且易受电解质、温度和酸碱度等条件的影响。（二）抗原抗体反应的影响因素1电解质 抗原、抗体通常为蛋白质分子，等电点分别为pH35和56不等，在中性或弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分的负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝集团块或沉淀物。实验中常用0.85%的NaCl或其他离子溶液作稀释液，以提供适当浓度的电解质。 2温度 适当提高反应的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的形成。在一定范围内，温度越高，形成可见反应的速度越快。但温度过高（56以上），可使抗原或抗体变性失活，影响实验结果。通常37是抗原抗体反应的最适温度。3酸碱度 抗原抗体反应的最适pH在68之间，pH过高或过低，均可直接影响抗原、抗体的理化性质。此外，当抗原抗体反应液的pH接近抗原或抗体的等电点时，抗原抗体所带正、负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应，即假阳性反应。第二节 检测抗原和抗体的体外试验抗原和其相应抗体在体外相遇可发生特异性结合，由于该反应是高度特异性的，因此可以用已知的抗原（或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）。由于抗原物理性状的差异或参加反应的其他辅助成分的不同，可出现不同类型的反应。如凝集反应、沉淀反应、中和反应及免疫标记技术等。实验所采用的抗体常存在于血清中（还可存在于关节液、脑脊液、腹水及胸水中），因此习惯上将体外的抗原-抗体反应称之为血清学反应（serological reaction）或血清学试验。1凝集反应（agglutination reactions）： 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质（如聚苯乙稀乳胶等）与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象，称为凝集反应。凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应两种。（1）直接凝集反应（direct agglutination reactions）：颗粒性抗原本身直接与相应的抗体反应出现的凝集现象，如红细胞凝集或细菌凝集。 （2）间接凝集反应（indirect agglutination reactions）：将可溶性抗原或抗体先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应抗体或抗原进行反应产生的凝集现象，称为间接凝集反应。直接凝集反应和间接凝集反应亦常用于溶血性疾病的诊断，如Rh血型不符的新生儿溶血症及药物相关的溶血性疾病。2沉淀反应（precipitation reactions）： 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。3免疫标记技术（immunolabeling techniques）：免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。为了提高单纯的抗原和抗体检测的灵敏性，将已知的抗体或抗原标记上示踪物质，通过检测标记物，间接测定抗原抗体复合物。常用的标记物有酶、荧光素、放射性核素、胶体金及化学发光物质等。免疫标记技术极大地提高了抗原抗体反应的灵敏度，不但能对抗原或抗体进行定性和精确定量测定，而且结合光镜或电镜技术，能观察抗原、抗体或抗原抗体复合物在组织细胞内的分布和定位。（1）免疫酶测定法（enzyme immunoassay，EIA）：这是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。常用的有酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和酶免疫组化技术。ELISA法需将抗原或抗体与一固相载体（常为聚苯乙烯板）连接，然后再进行酶免疫反应。酶免疫组化法用于测定组织或细胞中的抗原。酶免疫检测技术可用于激素、药物等半抗原的检测，也可用于大分子蛋白质、病毒和细胞性抗原成分的检测。由于ELISA检测技术方法简单、特异性强，因此是酶免疫技术中应用最广泛的技术。1）双抗体夹心法（sandwich ELISA）2）间接EILSA3）BAS -ELISA4）微粒捕获酶免疫分析技术（microparticle enzyme immunoassay, MEIA）5）免疫组化技术（immunohistochemistry technique）（2）免疫荧光技术（immunofluorescence technique）：又称荧光抗体技术，是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。（3）放射免疫测定法（radioimmunoassay, RIA）：是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测，敏感性可达到pg/ml水平。常用的放射性核素有131I和125I等。（4）化学发光免疫技术：（chemiluminescence immunoassay, CLIA）：是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。该方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性，而且还具有分离简便、可以实现自动化分析的特点。将发光物质如鲁米诺，标记抗体或抗原进行反应，以发光现象作为抗原-抗体反应的指示系统，可定量检测抗原或抗体。包括发光酶免疫分析、化学发光免疫分析和电化学发光分析。 （5）免疫胶体金技术：（immunological colloidal gold signature, ICS）：用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。氯金酸（HAuCl4）在还原剂的作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。该溶液因静电作用而呈稳定的胶体状态，故称胶体金。在碱性条件下，胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团靠静电引力结合。由于胶体金的电子密度高，颗粒聚集后呈红色，因此可用于标记多种大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。（6）免疫印迹技术（immunoblotting）：又称Western blotting，是将十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离得到的按分子量大小排列的蛋白转移到固相载体膜上，再用标记的特异性的抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术，其鉴定蛋白质的敏感性为15ng。该技术已被广泛地用于医学研究领域。免疫印迹法的基本步骤为：第一步是电泳分离蛋白抗原，将可溶性抗原或溶解状态的细胞裂解液进行SDS-PAGE。第二步是将SDS-PAGE分离的蛋白条带转移至固相的硝酸纤维素膜（NC）或聚偏二氟乙烯（PVDF）上。第三步，转印到膜上的蛋白条带可用酶标记的一抗或二抗进行特异性反应，加入显色底物以显示结果。4蛋白质芯片技术 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列（protein microarray），是指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。蛋白质芯片的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于介质载体上成为检测的芯片，再用标记特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，在将未与芯片上的蛋白质结合的抗体洗去之后，利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其相互结合的程度。抗体芯片是指将抗体固定到芯片表面，其特异性结合能力，检测相应的抗原。抗原、抗体芯片在微生物感染检测中具有广泛的应用价值。第三节 免疫细胞功能的检测为了检测机体的免疫功能，可以通过体外或体内实验对参与免疫应答的不同细胞进行分离、鉴定及功能测定。用于上述免疫功能检测的材料最常用的是外周血，也可以是胸腺、脾、淋巴结及各种组织。一、免疫细胞的分离体外测定免疫细胞的功能，首先要从不同材料中分离所需细胞。根据细胞的表面标志、理化性质及功能进行设计和选择不同的分离方法。（一）外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。PBMC是免疫学实验最常用的细胞，也是进行T、B细胞分离纯化过程的第一步。常用的分离方法是葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll-Urografin）密度梯度离心法。（二）淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离有多种方法，如玻璃黏附法、尼龙毛分离法、E花环形成分离法等。由于单克隆抗体的应用和免疫学技术的发展，可通过以下方法进行分离。1免疫吸附分离法 将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应细胞表面标志的淋巴细胞被贴附在培养板上，可与细胞悬液中其他细胞分开。2磁珠分离法（immune magnetic bead, IMB） 近年来免疫磁珠法应用较广泛，是一种特异性分离所需淋巴细胞的方法。3荧光激活细胞分离仪分离法（fluorescence activated cell sorting, FACS） FACS又称流式细胞术（flow cytometry, FCM），是一种集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析方法。4抗原肽-MHC分子四聚体技术：将特异性抗原肽段、可溶性MHC类分子重链及2微球蛋白在体外正确折叠，在亲和素存在下，构建四聚体（tetramer），并结合流式细胞仪定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比率。 二、免疫细胞功能的测定检测T、B细胞的数量及功能有助于某些疾病的辅助诊断、疗效观察及科研分析。1T细胞功能测定（1）T淋巴细胞增殖试验：T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，可通过以下三种方法检测。1）形态计数法2）3H-TdR或125-UdR掺入法3）MTT比色法（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血、渗出，于2448小时发生，72小时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的可发生水肿，甚至坏死。2B细胞功能测定（1）可通过单向琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中IgG、 IgA、 IgM等各类Ig的含量。（2）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验。3细胞毒试验：细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。（1）51Cr释放法（2）乳酸脱氢酶释放法（3）细胞染色法（4）凋亡细胞检测法4吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-）能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞，可反应中性粒细胞的杀伤功能。（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。5细胞因子的检测 细胞因子的检测主要有生物活性检测法、免疫学检测法和分子生物学技术检测法。（1）生物活性检测法：根据不同的细胞因子具有的不同的生物学活性，可采取相应的测定方法。（2）免疫学检测法：几乎所有的细胞因子都可以用ELISA（双抗体夹心法）进行检测。胞内细胞因子检测法酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot, ELISPOT） 12