part遗传毒理学.pptx

第一节 遗传毒理学及其相关概念突变突变(mutation)：生物体遗传物质发生的可遗传的变化生物体遗传物质发生的可遗传的变化(遗传物质发生的变化及引起的变异遗传物质发生的变化及引起的变异)。自发性突变自发性突变(spontaneous mutation)：自然条件下发生自然条件下发生的突变。的突变。诱发性突变诱发性突变(induced mutation)：人为地或受各种因素人为地或受各种因素诱发产生的突变。诱发产生的突变。致突变性致突变性(mutagenicity)：化学物质和其他环境因素引化学物质和其他环境因素引起遗传物质发生突变的能力。起遗传物质发生突变的能力。致突变作用致突变作用(mutagensis)：化学物质和其他环境因素引：化学物质和其他环境因素引起生物体遗传物质的突变效应。起生物体遗传物质的突变效应。突变是毒理学中的一种损害作用突变是毒理学中的一种损害作用化学致突变剂化学致突变剂(chemical mutagen)(chemical mutagen)：能引起：能引起致突变作用的化学物质。致突变作用的化学物质。Direct-acting mutagenDirect-acting mutagenIndirect-acting mutagenIndirect-acting mutagen遗传毒理学遗传毒理学(genetic toxicology)(genetic toxicology)：研究化学性研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物质可能引起的健康效应的学科。突变物质可能引起的健康效应的学科。研究目的或内容：研究目的或内容：致突变作用的机制致突变作用的机制 致突变物质致突变物质 检测及其评价致突变健康危害的方法检测及其评价致突变健康危害的方法遗传毒性遗传毒性(genetic toxicity)(genetic toxicity)：对基因的损害：对基因的损害能力。包括对基因组的毒性作用引起的致突能力。包括对基因组的毒性作用引起的致突变性及其他各种不同的效应变性及其他各种不同的效应(如原发性如原发性DNADNA损损伤伤)，包括致突变性。包括致突变性。遗传毒性的效应可能转变为突变，也可能被修遗传毒性的效应可能转变为突变，也可能被修复。复。第二节 外源化学物的致突变作用遗传学损伤的类型：遗传学损伤的类型：基因突变基因突变(gene mutation)：基因中：基因中DNA序列的变化。也称点突序列的变化。也称点突变变(point mutatiion)，是组成一个染色体的一个或几个基因发，是组成一个染色体的一个或几个基因发生变化。生变化。不能用光学显微镜直接观察，须通过生长发育、生化、形不能用光学显微镜直接观察，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。目前，可直接分析态等表型改变来判断。目前，可直接分析DNA序列。序列。染色体畸变染色体畸变(chromosome abrration)：染色体结构的改变。：染色体结构的改变。基因组突变基因组突变(染色体数目改变染色体数目改变)(genomic mutation)：是某一个或：是某一个或几个染色体的结构或染色体的数目发生变化，用光学显微镜几个染色体的结构或染色体的数目发生变化，用光学显微镜可直接进行观察。可直接进行观察。三者本质相同，区别是受损程度。三者本质相同，区别是受损程度。一、基因突变一、基因突变：基因中：基因中DNA序列的变化序列的变化1、碱基转换、碱基转换(取代取代)(base substitution)：DNA多核苷酸多核苷酸链上链上某一碱基某一碱基为另一种碱基所取代所致的突变。为另一种碱基所取代所致的突变。转换转换(transition)：同类碱基之间的取代。：同类碱基之间的取代。嘌呤之间或嘧啶之间嘌呤之间或嘧啶之间颠换颠换(transversion)：不同类的碱基取代。：不同类的碱基取代。嘌呤为嘧啶所取代或嘧啶为嘌呤取代嘌呤为嘧啶所取代或嘧啶为嘌呤取代碱基转换的结果：碱基转换的结果：错义突变：密码子改变错义突变：密码子改变另一种氨基酸另一种氨基酸蛋白质功能变蛋白质功能变化化无义突变：密码子改变无义突变：密码子改变终止密码终止密码翻译中止翻译中止同义突变：同义突变：密码子意义不变密码子意义不变终止密码突变：肽链延长到下一个终止密码终止密码突变：肽链延长到下一个终止密码2 2、移码突变、移码突变(frameshift mutation)(frameshift mutation)：DNADNA碱基碱基序列中，插入或缺失了序列中，插入或缺失了一对或几对一对或几对碱基碱基(3(3的倍的倍数除外数除外)，以致从受损点开始碱基序列完全改，以致从受损点开始碱基序列完全改变，指导合成的肽链全部发生变化。变，指导合成的肽链全部发生变化。3 3、密码子缺失或插入、密码子缺失或插入：缺失或插入的碱基数恰：缺失或插入的碱基数恰好是一个或多个三联体，指导合成的肽链增加好是一个或多个三联体，指导合成的肽链增加或减少一个或几个氨基酸，此部位以后的氨基或减少一个或几个氨基酸，此部位以后的氨基酸序列不变。酸序列不变。二、染色体畸变(chromsome aberration)：染色体染色体结构的异常。结构的异常。在致突变物的作用下，在致突变物的作用下，DNA分子结构的完整性分子结构的完整性遭破坏，染色体或染色单体断裂，再经断裂重遭破坏，染色体或染色单体断裂，再经断裂重接或互换，产生多种类型畸变。接或互换，产生多种类型畸变。染色单体型畸变染色单体型畸变(chromatid-type aberration)：涉涉及两条染色单体中的一条，在下一次细胞分裂及两条染色单体中的一条，在下一次细胞分裂衍生为染色体畸变衍生为染色体畸变染色体型畸变染色体型畸变(chromsome-type aberration)：涉及涉及两条单体两条单体染色体结构异常的类型：染色体结构异常的类型：1)缺失：染色体上丢失了一个片段缺失：染色体上丢失了一个片段2)重复：在一套染色体里，一个染色体片段出重复：在一套染色体里，一个染色体片段出现多次。现多次。3)倒位：一个染色体片段被颠倒，有臂内倒位：一个染色体片段被颠倒，有臂内(着丝着丝点不变点不变)或臂间倒位。或臂间倒位。4)易位：一个染色体片段的位置发生改变。常易位：一个染色体片段的位置发生改变。常见的为相互易位，涉及两个非同源染色体片见的为相互易位，涉及两个非同源染色体片段的交换。段的交换。稳定的畸变：稳定的畸变：可通过重复细胞分裂传给子代，可通过重复细胞分裂传给子代，如缺失、倒位、及平衡易位，多数为染色体如缺失、倒位、及平衡易位，多数为染色体重排。重排。-可用染色体分带染色技术检出，较可用染色体分带染色技术检出，较费工。费工。不稳定的畸变不稳定的畸变：各种不对称的重排，通常由于：各种不对称的重排，通常由于丧失重要遗传物质或有丝分裂障碍导致细胞丧失重要遗传物质或有丝分裂障碍导致细胞死亡。死亡。某种化学物引起染色体型或染色单体型畸变，某种化学物引起染色体型或染色单体型畸变，主要取决于该化学物的性质和靶细胞所处的主要取决于该化学物的性质和靶细胞所处的周期。周期。G0或或G1期：染色体型损伤期：染色体型损伤S和和G2期：染色单体型畸变期：染色单体型畸变细胞在有丝分裂前期受作用，导致的亚染色单细胞在有丝分裂前期受作用，导致的亚染色单体畸变，要在分裂后期才能见到；体畸变，要在分裂后期才能见到；在有丝分裂中期受作用，要在下一次分裂时才在有丝分裂中期受作用，要在下一次分裂时才能见到染色体畸变。能见到染色体畸变。三、基因组突变三、基因组突变(genomic mutation)：基因组基因组中染色体数目的改变中染色体数目的改变整倍体：以染色体组为单位的增减。如：单整倍体：以染色体组为单位的增减。如：单倍体、三倍体、四倍体等。三倍体以上为倍体、三倍体、四倍体等。三倍体以上为多倍体多倍体非整倍体：细胞核内染色体数不是染色体组非整倍体：细胞核内染色体数不是染色体组的倍数。如单体、三体、四体、双三体、的倍数。如单体、三体、四体、双三体、缺体等。缺体等。第三节外源化学物致突变作用的机制及其后果化学物作用细胞部位不同，产生不同的突变：化学物作用细胞部位不同，产生不同的突变：诱导基因突变和染色体畸变的主要靶分子为诱导基因突变和染色体畸变的主要靶分子为DNADNA，诱导基因组突变的靶部位常是有丝分，诱导基因组突变的靶部位常是有丝分裂和减数分裂的成分，如纺锤丝。裂和减数分裂的成分，如纺锤丝。一、引起突变的DNA变化致突变作用的基础是致突变作用的基础是DNADNA结构的理化性质的改变。结构的理化性质的改变。DNADNA的损伤的损伤有多种类型。有多种类型。(一一)、碱基损伤、碱基损伤1 1、碱基错配：、碱基错配：如烷化剂，对如烷化剂，对DNADNA和蛋白质都有强烈的烷化作用。和蛋白质都有强烈的烷化作用。2 2、平面大分子嵌入、平面大分子嵌入DNADNA链：链：平面结构的多环化合物，如前黄素、平面结构的多环化合物，如前黄素、溴乙啶，可以非共价结合的形式插入溴乙啶，可以非共价结合的形式插入DNADNA的碱基对之间，使的碱基对之间，使相邻碱基对之间的距离增大，影响相邻碱基对之间的距离增大，影响DNADNA复制。复制。3 3、碱基类似物取代：、碱基类似物取代：化学物结构与碱基相似，在化学物结构与碱基相似，在DNADNA合成期中，合成期中，取代正常碱基，造成错误配对。如取代正常碱基，造成错误配对。如5-5-溴脱氧尿苷与胸腺嘧啶溴脱氧尿苷与胸腺嘧啶相似，造成相似，造成DNADNA损伤损伤4 4、碱基化学结构改变或破坏：、碱基化学结构改变或破坏：氧化碱基，如亚硝酸盐致腺嘌呤氧化碱基，如亚硝酸盐致腺嘌呤和胞嘧啶氧化性脱氧。和胞嘧啶氧化性脱氧。(二二)DNA)DNA链受损链受损1 1、二聚体的形成：、二聚体的形成：如如DNADNA同一条鏈上，相邻的嘧啶形同一条鏈上，相邻的嘧啶形成二聚体成二聚体2 2、DNADNA加合物形成加合物形成：活性化学物与：活性化学物与DNADNA分子之间通过共分子之间通过共价键形成稳定的复合物。如烷化剂与价键形成稳定的复合物。如烷化剂与DNADNA加合物加合物(局局部扭曲或二级结构构象紊乱部扭曲或二级结构构象紊乱)，与碱基生成加合物，与碱基生成加合物(碱基置换碱基置换)3 3、DNA-DNA-蛋白质交联物形成：蛋白质交联物形成：一般为核蛋白，交联后对一般为核蛋白，交联后对DNADNA构象造成影响，并影响构象造成影响，并影响DNADNA复制与转录的调控。复制与转录的调控。二、引起突变的细胞分裂过程的改变二、引起突变的细胞分裂过程的改变非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常产生，涉及非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常产生，涉及纺锤体、微管蛋白等纺锤体、微管蛋白等与纺锤体有关的机制：与纺锤体有关的机制：1、与微管蛋白二聚体、与微管蛋白二聚体(构成结合纺锤体的基本成分构成结合纺锤体的基本成分)：如秋水仙碱如秋水仙碱2、与微管上巯基结合：如甲基汞、与微管上巯基结合：如甲基汞3、已组装好微管的破坏：如秋水仙碱、灰黄霉素等、已组装好微管的破坏：如秋水仙碱、灰黄霉素等4、中心粒移动受阻：如秋水仙碱、中心粒移动受阻：如秋水仙碱5、其他作用：如、其他作用：如N2O三、其他改变1、DNA复制的高保真性：多种酶类复制的高保真性：多种酶类2、修复：修复过程及其基因与酶、修复：修复过程及其基因与酶四、突变的后果靶细胞的类型决定突变对人类健康的影响：靶细胞的类型决定突变对人类健康的影响：体细胞：影响个体，可能与肿瘤发生有关；体细胞：影响个体，可能与肿瘤发生有关；生殖细胞：遗传下一代生殖细胞：遗传下一代孕体体细胞：新生儿的存在或畸形，流产、死胎等孕体体细胞：新生儿的存在或畸形，流产、死胎等(一一)生殖细胞：生殖细胞：1、对机体无影响：如无义突变、对机体无影响：如无义突变2、导致正常人体生化组成的异常：如、导致正常人体生化组成的异常：如ABO血型，在血型，在特殊情况下，可引起严重后果，如输血。特殊情况下，可引起严重后果，如输血。3、导致遗传易感性的改变、导致遗传易感性的改变4、导致遗传性疾病、导致遗传性疾病5、致死突变：配子死亡、死胎、自发流产、致死突变：配子死亡、死胎、自发流产DNADNA损伤修复障碍损伤修复障碍生殖细胞突变生殖细胞突变显性显性致死致死隐性隐性致死致死存活存活突变突变流产、死胎流产、死胎出生缺陷、基因负荷出生缺陷、基因负荷先天性疾病先天性疾病一种物种的群体中一种物种的群体中每一个携带的可每一个携带的可遗传给下一代的有遗传给下一代的有害基因的平均水平害基因的平均水平纯合子或半合子纯合子或半合子出现死亡出现死亡致死性突变：致死性突变：影响后代数量影响后代数量(死胎死胎)显性致死：显性致死：精子不能受精，或合子在着床前或着精子不能受精，或合子在着床前或着床后早期胚胎死亡床后早期胚胎死亡隐性致死：隐性致死：需纯合子或半合子才出现死亡，杂合需纯合子或半合子才出现死亡，杂合子则不死亡子则不死亡非致死性突变：非致死性突变：影响后代质量影响后代质量显性遗传：显性遗传：下一代遗传病发生率增加或新病种出下一代遗传病发生率增加或新病种出现现隐性遗传：隐性遗传：增加下一代基因负荷增加下一代基因负荷DNADNA损伤修复障碍损伤修复障碍体细胞突变体细胞突变良性良性肿瘤肿瘤细胞细胞衰老衰老未分化的未分化的胚胎细胞胚胎细胞受损受损动脉动脉硬化硬化未知疾病未知疾病出生缺陷出生缺陷(功能或功能或结构畸形结构畸形)恶性恶性肿瘤肿瘤已分化的已分化的胚胎细胞胚胎细胞受损受损癌癌变变老老 化化出生缺陷出生缺陷(流产、死胎流产、死胎、癌变、癌变(二二)体细胞突变体细胞突变第四节 机体对致突变作用的影响 DNA DNA可受到自发性化学降解、氧化、非酶可受到自发性化学降解、氧化、非酶甲基以及环境中化学致突变物、辐射等因素甲基以及环境中化学致突变物、辐射等因素的影响，而受到损伤，但遗传物质在所有的的影响，而受到损伤，但遗传物质在所有的物种中均能世代相传。其原因：物种中均能世代相传。其原因：1)DNA1)DNA执行高度保真复制：对复制中的错误执行高度保真复制：对复制中的错误能及时纠正，即通过修复而达到高度保真。能及时纠正，即通过修复而达到高度保真。2)2)机体有多种机制修复机体有多种机制修复DNADNA损伤，以保护亲损伤，以保护亲代代DNADNA链，使其免受化学毒物的作用。链使其免受化学毒物的作用。机体修复机制：损伤耐受机制和修复机制机体修复机制：损伤耐受机制和修复机制 接触化学致突变物接触化学致突变物致突变作用致突变作用在个体之间，反应有很大差异在个体之间，反应有很大差异个体对致突变物敏感性差异的原因个体对致突变物敏感性差异的原因：代谢酶的遗传多态性代谢酶的遗传多态性 修复能力差异修复能力差异 宿主因素宿主因素细胞处理广泛的细胞处理广泛的DNADNA损伤有两个过程：损伤有两个过程：如果如果损伤是广泛的，细胞发生凋亡；损伤是广泛的，细胞发生凋亡；如果如果损伤不十分严重，细胞进行多种修复，使损伤不十分严重，细胞进行多种修复，使NDANDA回到未损伤状态回到未损伤状态(无错误修复无错误修复)或到一个或到一个有所改善但仍发生了改变的状态有所改善但仍发生了改变的状态(错误倾向错误倾向修复修复)。大多数修复过程的基本原则是：损伤识别，移大多数修复过程的基本原则是：损伤识别，移除损伤片段，修复除损伤片段，修复DNADNA合成和连接。合成和连接。一、DNA损伤修复1 1、直接修复、直接修复多数生物体存在两种直接修复机制：多数生物体存在两种直接修复机制：(1)(1)光复活：一种依赖光的过程，通过光复活：一种依赖光的过程，通过DNADNA光光裂合酶裂合酶逆转紫外线逆转紫外线(UV)(UV)诱导的嘧啶二聚体；诱导的嘧啶二聚体；(2)O(2)O6 6-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤DNA-DNA甲基转移酶修复甲基转移酶修复(“(“适应性适应性”反应反应)：通过甲基鸟嘌呤：通过甲基鸟嘌呤DNADNA甲基甲基转移酶转移酶去除去除DNADNA中中O O6 6-甲基鸟嘌呤的甲基鸟嘌呤的O O6 6-甲基甲基基团，使鸟嘌呤恢复其正常的碱基配对特基团，使鸟嘌呤恢复其正常的碱基配对特性。性。2 2、切除修复、切除修复：涉及较大范围损伤的修复机制：涉及较大范围损伤的修复机制(1)(1)核苷酸切除修复核苷酸切除修复(NER)(NER)：通过一系列步骤：通过一系列步骤(识识别、切开、切除、修复合成和连接别、切开、切除、修复合成和连接)从从DNADNA上移上移除有损伤片段的寡核苷酸片段。除有损伤片段的寡核苷酸片段。转录活跃基因的转录活跃基因的DNADNA修复，尤其是被转录链修复，尤其是被转录链较基因组中其他的较基因组中其他的DNADNA损伤优先和快速修复。损伤优先和快速修复。(2)(2)碱基切除修复碱基切除修复：主要途径是移除损伤的碱基，：主要途径是移除损伤的碱基，空隙由空隙由DNADNA多聚酶填充，然后与母体多聚酶填充，然后与母体DNADNA连接。连接。氧化性损害不管是先天还是后天诱导的，氧化性损害不管是先天还是后天诱导的，均是碱基切除修复的底物。均是碱基切除修复的底物。3 3、错配修复、错配修复(mismatch repair)(mismatch repair)：可以识别并可以识别并除去错配的碱基。主要是通过一个特定的连除去错配的碱基。主要是通过一个特定的连接在错误配对处的蛋白质识别损伤，并在该接在错误配对处的蛋白质识别损伤，并在该处增加一个或多个蛋白质使结合更为稳固，处增加一个或多个蛋白质使结合更为稳固，在距错误配对一定距离处切割在距错误配对一定距离处切割DNADNA，切除错，切除错误配对，重新合成和连接。误配对，重新合成和连接。4 4、双链断裂修复、双链断裂修复：未修复的双链断裂触发未修复的双链断裂触发DNADNA损伤反应系统，损伤反应系统，使细胞阻滞于周期的某一期或诱发凋亡。使细胞阻滞于周期的某一期或诱发凋亡。(1)(1)同源重组：同源重组：(2)(2)非同源末端连接非同源末端连接(NHEJ)(NHEJ)：5 5、交联修复：、交联修复：DNADNA链内交联时，会造成双链断链内交联时，会造成双链断裂，启动两种修复。裂，启动两种修复。(1)(1)无误交联修复无误交联修复(2)(2)易误交联修复易误交联修复不同的修复途径可以共用某些酶和中间体，不同的修复途径可以共用某些酶和中间体，特定的特定的DNADNA损伤可以通过一种或多种修复途径修损伤可以通过一种或多种修复途径修复，复，不同的修复途径可能竞争同一底物，相互干扰不同的修复途径可能竞争同一底物，相互干扰彼此功能；也可能协同去除损伤。彼此功能；也可能协同去除损伤。二、遗传因素对致突变作用的影响化学致突变模式：化学致突变模式：损伤损伤-修复修复-突变突变修复功能饱和或能力不足修复功能饱和或能力不足 突变突变如肿瘤发生率每年约为如肿瘤发生率每年约为1%1%吸烟者中患肺癌约有吸烟者中患肺癌约有10%10%先天性先天性(遗传因素遗传因素)，即遗传多态性，即遗传多态性后天性后天性(生活方式生活方式)，个体因素个体因素第五节 观察外源化学物致突变作用的基本方法致突变试验：有致突变试验：有200200余种，常用约余种，常用约2020种种一、观察项目的选择一、观察项目的选择 1、观察效应终点及类型、观察效应终点及类型：遗传学终点遗传学终点(genrtic endpoint)：致突变试验的观察终点：致突变试验的观察终点 基因突变；染色体畸变；染色体组畸变基因突变；染色体畸变；染色体组畸变(非整倍体非整倍体)原发性原发性DNADNA损伤损伤(DNA(DNA原始损伤原始损伤)遗传毒理学试验是通过直接检测遗传学终点或检测导致遗传毒理学试验是通过直接检测遗传学终点或检测导致某一终点的某一终点的DNA损伤过程伴随的现象，来确定外源损伤过程伴随的现象，来确定外源化学物产生遗传物质损伤并导致遗传性改变的能力。化学物产生遗传物质损伤并导致遗传性改变的能力。DNA的基本特性具有普遍性，故用非人类检测系统预的基本特性具有普遍性，故用非人类检测系统预测对人类的遗传危害性。测对人类的遗传危害性。指示生物：病毒、细菌、霉菌、昆虫、植物、培养的指示生物：病毒、细菌、霉菌、昆虫、植物、培养的哺乳动物细胞和哺乳动物哺乳动物细胞和哺乳动物没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学终点，常用没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学终点，常用一组试验配套进行检测。一组试验配套进行检测。2、成套观察项目：、成套观察项目：采用何种方法，根据需要采用何种方法，根据需要如食品、工业毒物的遗传毒理学评价程序：如食品、工业毒物的遗传毒理学评价程序：包括基因包括基因突变、断裂作用、重组作用、非整倍体或多倍体测突变、断裂作用、重组作用、非整倍体或多倍体测定。定。受试物在其中任何一种试验中出现可重复的阳受试物在其中任何一种试验中出现可重复的阳性结果，即可认为是遗传毒性。性结果，即可认为是遗传毒性。入选遗传毒理学成套观察项目的原则：入选遗传毒理学成套观察项目的原则：1)一组试验系统应包括每一类型的遗传学终点一组试验系统应包括每一类型的遗传学终点2)配套试验应包括多种进化程度不同的物种配套试验应包括多种进化程度不同的物种3)体内与体外试验结合体内与体外试验结合如如ICHICH，19971997药品遗传毒性评价组合：药品遗传毒性评价组合：细菌基因突变；细菌基因突变；体外哺乳动物细胞染色体畸变或体外小鼠淋体外哺乳动物细胞染色体畸变或体外小鼠淋巴瘤细胞巴瘤细胞tk tk试验；试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验二、常用致突变试验基因突变试验应用基因突变试验应用选择技术选择技术检测突变检测突变选择技术是利用只有突变的细胞或微生物才能生长的选择技术是利用只有突变的细胞或微生物才能生长的实验条件实验条件，从许多未突变细胞中发现很少的突变细，从许多未突变细胞中发现很少的突变细胞。胞。利用选择技术可以在微生物和培养哺乳动物细胞检测利用选择技术可以在微生物和培养哺乳动物细胞检测正向突变和回复突变正向突变和回复突变。微生物和培养哺乳动物细胞缺乏整体动物的代谢能力，微生物和培养哺乳动物细胞缺乏整体动物的代谢能力，在许多遗传试验中，需加入在许多遗传试验中，需加入活化体系活化体系以检测出间接以检测出间接致突变物。致突变物。常用：大鼠肝细胞匀浆的微粒体上清液常用：大鼠肝细胞匀浆的微粒体上清液+缓冲液和辅缓冲液和辅助因子助因子-S9混合物混合物1 1、细菌回复突变试验、细菌回复突变试验(Ames(Ames试验试验)(bacterial reverse mutation assay)(bacterial reverse mutation assay)以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。变的体外试验。常用菌株：组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌常用菌株：组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌 色氨酸营养缺陷型大肠杆菌色氨酸营养缺陷型大肠杆菌原理：某个调控组氨酸合成的基因发生了点位突变，原理：某个调控组氨酸合成的基因发生了点位突变，丧失了合成组氨酸能力，必需依赖外源性组氨酸才丧失了合成组氨酸能力，必需依赖外源性组氨酸才能生长。突变菌株可被各种诱变因素诱导，回复突能生长。突变菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变为原养型，在不含组氨酸的选择培养基上生长成变为原养型，在不含组氨酸的选择培养基上生长成可见的菌落。如果选择培养基上回变菌落数显著超可见的菌落。如果选择培养基上回变菌落数显著超过了自发回变数，即可判断受试物为鼠伤寒沙门菌过了自发回变数，即可判断受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。的致突变物。图图 Ames试验原理试验原理鼠伤寒沙门菌原养型鼠伤寒沙门菌原养型(his+)(his+)组氨酸营养缺陷型突变株组氨酸营养缺陷型突变株(his-)(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变受试物受试物代谢活化系统代谢活化系统AmesAmes试验有多种菌株，组氨酸突变部位不同、方式试验有多种菌株，组氨酸突变部位不同、方式不同，附加的基因型改变也不同，不同的菌株对不同，附加的基因型改变也不同，不同的菌株对不同化学致突变物的检出能力不同。不同化学致突变物的检出能力不同。因此：试验中的菌株也要配套！因此：试验中的菌株也要配套！AmesAmes试验根据菌株特性，可测定：碱基置换、移码试验根据菌株特性，可测定：碱基置换、移码突变或两者。突变或两者。ICHICH推荐菌株：推荐菌株：TA98TA98、TA100TA100、TA1535TA1535、TA1537TA1537或或TA97(TA97a)TA97(TA97a)TA102TA102或或E.Coli WP2uvrAE.Coli WP2uvrA、E.Coli E.Coli WP2uvrA(pKM101)WP2uvrA(pKM101)我国我国：TA100TA100、TA98TA98、TA97TA97、TA102TA102（19831983年）年）AmesAmes试验方法：试验方法：点试验法：一般用于预试验点试验法：一般用于预试验 平板掺入法：标准方法平板掺入法：标准方法 预培养法：提高测试的灵敏度预培养法：提高测试的灵敏度常用的基因座位：常用的基因座位：tk tk：位于常染色体，产物为胸苷激酶（：位于常染色体，产物为胸苷激酶（TKTK）hprt:hprt:位于位于X X染色体，产物为次黄嘌呤转磷酸核染色体，产物为次黄嘌呤转磷酸核糖基酶（糖基酶（HPRTHPRT）。）。哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验(mammalian cell gene mutation assay)(mammalian cell gene mutation assay)基因正向突变试验基因正向突变试验(即野生型基因失活的突变即野生型基因失活的突变)常用方法：常用方法：小鼠淋巴瘤小鼠淋巴瘤(L5178Y)细胞胸苷激酶位点细胞胸苷激酶位点(tk)突变检测突变检测中国仓鼠卵巢中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺细胞、中国仓鼠肺(V79)细胞次细胞次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点(hgpt)突变检测突变检测中国仓鼠卵巢细胞的中国仓鼠卵巢细胞的AS52细胞株黄嘌呤鸟嘌呤转磷细胞株黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点酸核糖基酶位点(gpt)突变检测突变检测可检测：可检测：座位内碱基置换、缺失、移码、重排座位内碱基置换、缺失、移码、重排附：其它的致突变试验检测生物一、微生物一、微生物1 1、大肠杆菌、大肠杆菌WP2WP2回复致突变试验回复致突变试验2 2、酵母菌正向、酵母菌正向回复突变分析回复突变分析二、哺乳动物细胞突变试验二、哺乳动物细胞突变试验三、昆虫致突变试验：三、昆虫致突变试验：黑腹果蝇性连锁隐性致死黑腹果蝇性连锁隐性致死(SLRL)(SLRL)试验：雄性生殖细胞遗传损伤试验：雄性生殖细胞遗传损伤分析分析果蝇体细胞分析果蝇体细胞分析四、哺乳动物致突变试验四、哺乳动物致突变试验1 1、生殖细胞突变试验：小鼠特异位点测试、生殖细胞突变试验：小鼠特异位点测试(SLT)(SLT)(生殖细胞生殖细胞)2 2、简单串联重复、简单串联重复(ESTR)(ESTR)突变试验突变试验3 3、体细胞突变试验：小鼠体细胞皮毛斑点突变测试、体细胞突变试验：小鼠体细胞皮毛斑点突变测试五、转基因动物突变试验五、转基因动物突变试验2、染色体畸变测试、染色体畸变测试-微核试验微核试验微核微核(micronucleus)(micronucleus)：染色体片段或整条染色：染色体片段或整条染色体在细胞分裂过程中未按正常程序进入细胞体在细胞分裂过程中未按正常程序进入细胞核而滞留在细胞质中的染色质小体。核而滞留在细胞质中的染色质小体。微核微核通常作为染色体结构损伤、染色体分离异通常作为染色体结构损伤、染色体分离异常的常的标志标志。微核试验微核试验(micronucleus test(micronucleus test，MNT)MNT)：通过观：通过观察有微核的细胞率察有微核的细胞率()，用于检测断裂剂及，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。非整倍体诱发剂。微核试验的细胞微核试验的细胞：1)1)植物细胞：紫露草花粉母细胞、蚕豆根尖植物细胞：紫露草花粉母细胞、蚕豆根尖2)2)哺乳类动物细胞：骨髓细胞、肝细胞、脾细胞、肺哺乳类动物细胞：骨髓细胞、肝细胞、脾细胞、肺细胞、淋巴细胞、红细胞、精子、鼻及胃粘膜上皮细胞、淋巴细胞、红细胞、精子、鼻及胃粘膜上皮细胞、皮肤细胞等细胞、皮肤细胞等3)3)非哺乳类动物细胞：鱼红细胞、蟾蜍红细胞非哺乳类动物细胞：鱼红细胞、蟾蜍红细胞常用：常用：啮齿类动物骨髓多染红细胞啮齿类动物骨髓多染红细胞(PCE)(PCE)微核试验微核试验成红细胞成红细胞红细胞，主核排出红细胞，主核排出PCE 正染红细胞正染红细胞(NCE)，进入外周血。，进入外周血。主核排出时，微核可留存胞浆中。主核排出时，微核可留存胞浆中。微核试验的发展微核试验的发展：1)体外微核试验：中国仓鼠肺细胞体外微核试验：中国仓鼠肺细胞(CHL)、卵、卵巢细胞巢细胞(CHO)、成纤维细胞、成纤维细胞(V79)。易于控制。易于控制和操作和操作2)周围血微核试验：可用于人类观察周围血微核试验：可用于人类观察3)双核细胞法：体细胞培养体系中加入细胞松双核细胞法：体细胞培养体系中加入细胞松驰素驰素B，细胞质分裂受阻，形成双核，仅选，细胞质分裂受阻，形成双核，仅选择双核细胞进行微核计数。灵敏度提高择双核细胞进行微核计数。灵敏度提高4)免疫荧光染色法和荧光原位杂交法：灵敏度、免疫荧光染色法和荧光原位杂交法：灵敏度、精确度提高，判断微核来源（精确度提高，判断微核来源（片段或染色体片段或染色体）3、染色体畸变分析、染色体畸变分析(细胞遗传学试验细胞遗传学试验)制备细胞分裂中期染色体标本，在光镜下直接制备细胞分裂中期染色体标本，在光镜下直接观察染色体数目和形态的改变。观察染色体数目和形态的改变。体外染色体畸变试验：体外染色体畸变试验：指示细胞：指示细胞：CHO、CHL、V79、外周血淋巴细胞、外周血淋巴细胞染色体异常：染色体异常：裂隙、断裂、缺失、微小体、裂隙、断裂、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点、辐射体等着丝点环、无着丝点、辐射体等(耗时、技术要求娴熟，倾向于用微核试验代耗时、技术要求娴熟，倾向于用微核试验代替替)体内染色体畸变试验：体内染色体畸变试验：啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验 精原精原细胞胞：末次染毒后一天取样；：末次染毒后一天取样；初级精母细胞：染毒后初级精母细胞：染毒后12-14天取样天取样4、姐妹染色单体交换试验、姐妹染色单体交换试验(sister-chromatid exchange assay)原理原理：在：在DNA合成期，所有染色体均进行复合成期，所有染色体均进行复制，形成两条姐妹染色单体。姐妹染色单制，形成两条姐妹染色单体。姐妹染色单体交换体交换(SCE)可与可与DNA复制的断裂和重接复制的断裂和重接有关，故可间接反映有关，故可间接反映DNA损伤。损伤。方法：方法：在光学显微镜下，观察经光处理在光学显微镜下，观察经光处理(紫外紫外)和染色和染色(Giemsa)后的交换染色单体，计数后的交换染色单体，计数SCE数，判断受试物对数，判断受试物对DNA的损伤作用的损伤作用 结果较染色体分析枳度差结果较染色体分析枳度差5、果蝇伴性隐性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验(sex-linked recessive lethal test(sex-linked recessive lethal test，SLRL)SLRL)主要用于雄性生殖细胞遗传损伤分析。利用隐主要用于雄性生殖细胞遗传损伤分析。利用隐性基因在伴性性基因在伴性(性连锁性连锁)遗传中具有交叉遗传特遗传中具有交叉遗传特性。性。优点：优点：简便、经济。特异性高，几乎简便、经济。特异性高，几乎100%缺点缺点：敏感性低，与哺乳动物差异大：敏感性低，与哺乳动物差异大 阳性结果阳性结果(SLRL5倍对照倍对照)价值高价值高发展：发展：体细胞分析体细胞分析检测遗传变异检测遗传变异：重组、突变、染色体缺失：重组、突变、染色体缺失6、显性致死试验、显性致死试验(dominant lethal assay)显性致死显性致死(dominant lethal)：发育中的精子或卵子：发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，此损伤不影响受精，但导细胞发生遗传学损伤，此损伤不影响受精，但导致受精卵或发育中的胚胎死亡。主要由于染色体致受精卵或发育中的胚胎死亡。主要由于染色体损伤损伤(结构或数目结构或数目)。观察终点：胚胎早期死亡观察终点：胚胎早期死亡检测目标检测目标：受试物对性细胞染色体的损伤：受试物对性细胞染色体的损伤方法方法：对雄性动物染毒：对雄性动物染毒(卵子敏感性低卵子敏感性低)，与未染毒，与未染毒雌性交配，观察胚胎死亡情况。雌性交配，观察胚胎死亡情况。指示生物指示生物：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、果蝇等：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、果蝇等特点特点：实用，灵敏度差，动物数大：实用，灵敏度差，动物数大7、程序外、程序外DNA合成试验合成试验(unscheduled DNA synthesis test，UDS)程序外程序外DNA合成合成：正常细胞在有丝分裂过程中，仅：正常细胞在有丝分裂过程中，仅在在S期进行期进行DNA复制合成，当复制合成，当DNA受损后，受损后，DAN的修复合成可发生在正常复制合成期的修复合成可发生在正常复制合成期(S期期)以外的以外的其他时期。其他时期。方法：方法：同步培养细胞，将细胞阻断于同步培养细胞，将细胞阻断于G1期，受试物期，受试物处理，并加入标记处理，并加入标记DNA合成原料合成原料(3H胸腺嘧啶核胸腺嘧啶核苷苷)。DNA损伤，启动修复机制，标记物掺入到损伤，启动修复机制，标记物掺入到DNA链中，通过测定掺入量，检测修复合成，判链中，通过测定掺入量，检测修复合成，判断受试物作用。断受试物作用。指示生物指示生物：大鼠原代培养肝细胞、外周血淋巴细胞、：大鼠原代培养肝细胞、外周血淋巴细胞、人成纤维细胞、人成纤维细胞、Hela细胞等。细胞等。特点：经济、操作简便、无特殊设备特点：经济、操作简便、无特殊设备8、单细胞凝胶电泳试验、单细胞凝胶电泳试验(single cell gel electrophoresis，SCGE)彗星试验彗星试验(comet assay)(comet assay)，近年来发展的单细，近年来发展的单细胞水平检测有核细胞胞水平检测有核细胞DNADNA损伤与修复的方法。损伤与修复的方法。可进行体内或体外试验。可进行体内或体外试验。方法方法：制细胞悬液，裂解细胞获：制细胞悬液，裂解细胞获DNADNA，在碱，在碱性性(PH13)(PH13)溶液中获单链溶液中获单链DNADNA，碱性条件下，碱性条件下电泳，中和碱，显色和彗星观察电泳，中和碱，显色和彗星观察优点优点：对低水平：对低水平DNADNA损伤敏感性高，样品细损伤敏感性高，样品细胞数少，快速，简便胞数少，快速，简便缺点缺点：标准化、认可度不足：标准化、认可度不足9、技术进展、技术进展1)1)转基因动物致突变试验转基因动物致突变试验(transgenic animal(transgenic animal mutagenicity assay)mutagenicity assay)小鼠，基因回收分析，在体组织器官分析小鼠，基因回收分析，在体组织器官分析外源与内源靶基因反应的一致性需进一步证实，昂贵外源与内源靶基因反应的一致性需进一步证实，昂贵2)2)微核自动检测技术微核自动检测技术流式细胞仪、图像分析系统流式细胞仪、图像分析系统3)3)荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术精细结构、非整倍体检测精细结构、非整倍体检测准确、迅速、不同细胞准确、迅速、不同细胞(期期)探针不足探针不足三、遗传毒理学试验的应用