免疫原和抗血清的制备概要.pptx

免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清的制备 第一节免疫原的制备第一节免疫原的制备 免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质应的物质一、颗粒性抗原的制备：一、颗粒性抗原的制备：1.1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。2.2.细菌抗原：细菌抗原：H H抗原有动力的菌株抗原有动力的菌株O O抗原抗原 1001002-2.5h2-2.5h为为了了 破坏破坏H H抗原，获得抗原，获得O O抗原抗原ViVi抗原抗原3.3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V V内免疫，较内免疫，较少用佐剂作皮内注射少用佐剂作皮内注射二、可溶性抗原的制备：组织和细胞粗抗原的制备：组织和细胞粗抗原的制备：1.1.组织和细胞混合抗原的制备：组织和细胞混合抗原的制备：组织匀浆制备：组织匀浆制备：标本要求：新鲜或低温（标本要求：新鲜或低温（-40-40）保存的去除表面包膜或）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行结缔组织或一些大血管，脏器应进行 灌注，除去血管内残留灌注，除去血管内残留血液血液 制备制备处理好组织处理好组织0.050.05NaN3NaN3生理盐水洗净生理盐水洗净剪成小块剪成小块粉碎粉碎高速组织捣碎机法高速组织捣碎机法2000-3000rpm2000-3000rpm离心离心10min10min研磨法：玻璃匀浆器研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨乳钵研磨上清上清10000-20000rpm 20-30min10000-20000rpm 20-30min高速离心高速离心2.细胞抗原的制备：细胞抗原细胞膜蛋白抗原细胞抗原细胞膜蛋白抗原细胞浆抗原细胞浆抗原细胞核及核膜抗原细胞核及核膜抗原粉碎：粉碎：（1 1）反复冻融法）反复冻融法（2 2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸（3 3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏（4 4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系需一定需一定PHPH和温度动物组织和温度动物组织cellcell0-40-4微生物室温微生物室温（5 5）溶菌酶法：一定）溶菌酶法：一定PHPH（PH8.0PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织酶，纤维素酶消化细菌和组织cellcell（6 6）表面活性剂处理法）表面活性剂处理法 蛋白质抗原的制备和纯化：可溶性抗原绝大部分为蛋白质可溶性抗原绝大部分为蛋白质1 1.超速离心和梯度密度离心法：超速离心和梯度密度离心法：用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质1 1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离2 2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度即所谓梯度3 3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法白质抗原不适用此法2.选择性沉淀法：用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀1 1）核酸除去法：）核酸除去法：（1 1）提取沉淀剂：）提取沉淀剂：（2 2）核糖核酸酶降解法：用）核糖核酸酶降解法：用DNADNA或或RNARNA酶与提取液酶与提取液作用作用30-60min30-60min（4 4），即可除去核酸），即可除去核酸2 2）盐析沉淀法：）盐析沉淀法：（1 1）抗原的粗筛）抗原的粗筛33-5033-50饱和度的硫酸铵饱和度的硫酸铵（2 2）提取丙种球蛋白主要为）提取丙种球蛋白主要为IgGIgG33-4033-40饱和饱和度的硫酸铵度的硫酸铵（3 3）抗原的浓缩）抗原的浓缩3 3）有机溶剂沉淀法：）有机溶剂沉淀法：有机溶剂多为酒精和丙酮有机溶剂多为酒精和丙酮4 4）水溶性非离子型聚合物沉淀法：）水溶性非离子型聚合物沉淀法：PEG+PEG+蛋白质颗粒蛋白质颗粒沉淀、复合物、蛋白质发生水的沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量重分配分子量2000-6000PEG2000-6000PEG可用于沉淀蛋白可用于沉淀蛋白PEGPEG浓度不同可沉淀不同浓度不同可沉淀不同pro3-4pro3-4沉淀免疫复合物沉淀免疫复合物6-76-7沉淀沉淀IgMIgM8-128-12沉淀沉淀IgGIgG12-15%12-15%沉沉淀其他球蛋白淀其他球蛋白2525沉淀白蛋白沉淀白蛋白3.凝胶过滤和离子交换层析：1 1）分析筛层析又名凝胶过滤，将）分析筛层析又名凝胶过滤，将AgAg分成大、中、小三种分成大、中、小三种大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同子量不同 2 2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用异分组常用DEAEDEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）根据根据propro携带电荷不同（溶液中等电点不同）携带电荷不同（溶液中等电点不同）常用于分离常用于分离IgMIgM因为因为IgMIgM分子量大分子量大凝胶过滤洗脱曲线凝胶过滤洗脱曲线4.亲和层析：利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。egeg：AgAg和和AbAb，酶和酶的抑制剂，酶，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物和力，可紧密结合成复合物.1 1）亲和层析支持物的选择：）亲和层析支持物的选择：常用：琼脂糖珠（常用：琼脂糖珠（Sepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B6B）2 2）配体的选择：）配体的选择：3 3）抗原或抗体与支持物的结合：）抗原或抗体与支持物的结合：步骤：步骤：（1 1）活化支持物上的功能基因）活化支持物上的功能基因溴化氛溴化氛PH11PH11与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因（2 2）交联（联接）交联（联接）（3 3）清洗：除去未结合的）清洗：除去未结合的propro（4 4）亲和层析条件的选择：）亲和层析条件的选择：原理：一定条件下，原理：一定条件下，AgAg和和AbAb能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PHPH值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的AgAg解离（加入解脱剂），解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的经洗脱，从而得到纯化的AbAb。2）配体的选择：抗原或抗体与支持物的结合：抗原或抗体与支持物的结合：步骤：步骤：（1 1）活化支持物上的功能基团）活化支持物上的功能基团溴化氰溴化氰PH11PH11与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团（2 2）交联（联接）交联（联接）（3 3）清洗：除去未结合的）清洗：除去未结合的propro （4 4）亲和层析条件的选择：）亲和层析条件的选择：原理：在一定条件下，原理：在一定条件下，AgAg和和AbAb能可逆性地结合成复合物，当条件改变能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的洗脱液流出。再改变缓冲液的PHPH值和离子强度，则可以使抗体和偶联值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的在载体上的AgAg解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的AbAb。以免疫亲和层析为例（三）免疫球蛋白片段的制备：1 1）温和）温和 分离亚单位：分离亚单位：（1 1）改变）改变PHPH值值PHPH3 3或或1010，IgIg亚单位自动解离亚单位自动解离（2 2）利用强度性剂）利用强度性剂适合载脂蛋白适合载脂蛋白AgAg和胶原肽的提取和胶原肽的提取2 2）二硫键的解离：）二硫键的解离：适合于将轻、重链分开适合于将轻、重链分开3 3）溴化氰裂解法：）溴化氰裂解法：与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯4 4）酶法裂解：）酶法裂解：木瓜酶将木瓜酶将IgGIgG分解为分解为FcFc和和FabFab（22）三个片段）三个片段胃蛋白酶胃蛋白酶IgGIgG分解为（分解为（FabFab）2 2和几个小肽段和几个小肽段胰蛋白酶胰蛋白酶 IgGIgG切成不规则肽链切成不规则肽链 应用：木瓜酶切断，得应用：木瓜酶切断，得FcFc段，制备抗重链血清段，制备抗重链血清胃蛋白酶切取，得胃蛋白酶切取，得F F（abab）2 2，用于诊断（用，用于诊断（用AbAb鉴别鉴别AgAg）（四）纯化抗原的鉴定：1.1.含量鉴定：含量鉴定：生化方法酚试剂法生化方法酚试剂法双缩脲法可见光吸收法双缩脲法可见光吸收法 紫外吸收法紫外吸收法AgAg宝贵，少宝贵，少2 2纯度的鉴定：醋酸纤维薄膜电泳法纯度的鉴定：醋酸纤维薄膜电泳法 经典常用经典常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 免疫电泳法免疫电泳法 免疫双扩散法免疫双扩散法 ELISAELISA或或RIARIA（放免）（放免）不纯，也可能是同一物质的聚合体或降解物不纯，也可能是同一物质的聚合体或降解物较纯，也不能排除在这条带中有其他成分较纯，也不能排除在这条带中有其他成分所以单一方法，可信度差。因而几种方法联用较可靠所以单一方法，可信度差。因而几种方法联用较可靠 三、半抗原免疫原的制备 半抗原：只有反应原性，没有免疫原性的小分子物质半抗原：只有反应原性，没有免疫原性的小分子物质半抗原半抗原+载体载体大分子物质大分子物质-Ab-Ab人工抗原人工抗原结合方法物理法：利用电荷和微孔结合方法物理法：利用电荷和微孔化学法化学法（一）载体的选择：（一）载体的选择：1.1.蛋白质：常用牛血清白蛋白蛋白质：常用牛血清白蛋白2.2.多肽类聚合物：常用多聚赖多肽类聚合物：常用多聚赖aaaa3.3.大分子的聚合物和某些颗粒：加入福氏佐剂可产生良好大分子的聚合物和某些颗粒：加入福氏佐剂可产生良好AbAb（二）联接的方法：（二）联接的方法：三个基本条件：三个基本条件：1.1.碳化二亚胺法碳化二亚胺法;2.2.二醛法：二醛法：3.3.混合酸酐法（氯甲酸异丁酯法）混合酸酐法（氯甲酸异丁酯法）三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备：三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备：1.1.琥珀酸酐法琥珀酸酐法2.O-2.O-（羧甲基）羟胺法（羧甲基）羟胺法3.3.一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原4.4.重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原 四.佐剂：（一）使用佐剂的目的为提高免疫原性佐剂本身可有或无免疫原性（二）机理：1.可直接或参与cell免疫反应2.佐剂与Ag混合，可以使Ag在局部组织的存留时间长，延长Ag的局部吸收。可持续刺激机体，产生高滴度Ab3.佐剂可增加Ag表面积，并改变Ag的活性基因构型，从而增加Ag的免疫原性。常用的佐剂和制备方法：1.1.应用最多的为福氏佐剂应用最多的为福氏佐剂不完全：石蜡油不完全：石蜡油+羊毛脂羊毛脂完全：石蜡油完全：石蜡油+羊毛脂羊毛脂+卡介苗卡介苗2.2.乳剂的制备：乳剂的制备：乳剂：乳剂：AgAg和佐剂的混合物和佐剂的混合物AgAg与佐剂比例为与佐剂比例为1 1：1 1，注射前要充分乳化，注射前要充分乳化乳化方法研磨法乳化方法研磨法搅拌混合法搅拌混合法 旋涡混合旋涡混合 抗体的制备多克隆抗体的制备克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备第二节抗血清的制备第二节抗血清的制备 免疫原免疫原+佐剂佐剂刺激动物机体刺激动物机体获得抗血清获得抗血清一一.动物的选择动物的选择1.1.种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，甚至不产种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，甚至不产生生2.2.抗血清量的要求：量大，选大动物抗血清量的要求：量大，选大动物 量少，选小动物量少，选小动物3.3.抗血清的要求：抗血清的要求：R R型（兔型）型（兔型）H H型（马型）型（马型）4.4.抗原的选择：抗原的选择：蛋白质蛋白质AgAg大部分动物皆适合，常用家兔、山羊大部分动物皆适合，常用家兔、山羊IgEIgE对绵羊，胰岛素对家兔，对绵羊，胰岛素对家兔，酶对山羊免疫时不产生酶对山羊免疫时不产生AbAb5.5.甾体激素多用兔，酶多用豚鼠甾体激素多用兔，酶多用豚鼠6.6.对动物个体的要求：对动物个体的要求：雄性雄性 稚龄、健康、正常、无感染稚龄、健康、正常、无感染二、免疫前准备1.正常饲养：3d，观察是否健康、正常、无感染2.取阴性血清：耳静脉取血二、免疫剂量、时间和途径选择原则：1.1.剂量：大动物剂量：大动物0.5-1mg/0.5-1mg/只只 小动物小动物0.1-0.6mg/0.1-0.6mg/只只1 1）免疫剂量不要过大，）免疫剂量不要过大，AgAg过量，易产生免疫抑制过量，易产生免疫抑制2 2）第一次免疫剂量要小，多次免疫后可加大剂量）第一次免疫剂量要小，多次免疫后可加大剂量3 3）选择合适的免疫剂量，要根据）选择合适的免疫剂量，要根据AgAg性强弱，分子量大性强弱，分子量大 小，动物大小，免疫时间而定。小，动物大小，免疫时间而定。2.2.时间：时间：1 1）间隔时间短，易产生免疫抑制）间隔时间短，易产生免疫抑制一般第一般第1 1、2 2次间要有次间要有10-20d10-20d，2 2次以后次以后7-10d7-10d2 2）半抗原间隔时间长）半抗原间隔时间长 3.3.途径：多点注射，（足掌、腋窝途径：多点注射，（足掌、腋窝L L结周围，背部两侧，颌下，耳结周围，背部两侧，颌下，耳 后皮内或皮下注射）后皮内或皮下注射）AgAg宝贵，采取微量注射法宝贵，采取微量注射法免疫程序：1.背部皮下多点注射2.淋巴结内注射试血1.根据免疫程序末次免疫，从耳静脉取血分离血清2.琼脂双扩散测效价三.动物采血法：抗血清鉴定采血前，禁食动物采血前，禁食动物24h24h，防止血脂过高，防止血脂过高末次免疫后，末次免疫后，5-7d5-7d之内采血。否则抗血清之内采血。否则抗血清效价效价 1.1.颈动脉放血法：适于兔、羊颈动脉放血法：适于兔、羊2.2.心脏采血法：适于小动物心脏采血法：适于小动物3.3.静脉多次采血清免：耳中央静脉多次采血清免：耳中央V V100ML100ML 羊：颈羊：颈V V1500-2000ML1500-2000ML 小鼠：断尾或摘除眼球小鼠：断尾或摘除眼球2ML2ML抗血清分离，灭活抗血清分离，灭活565630min30min第三节抗血清的鉴定和保存第三节抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定：一、抗血清的鉴定：免疫成功，免疫成功，AbAb较纯较纯 ，含有杂，含有杂Ab Ab 免疫不成免疫不成功功1.1.特异性鉴定：免疫双扩散法特异性鉴定：免疫双扩散法2.2.效价的鉴定：免疫双扩散法效价的鉴定：免疫双扩散法AbAb稀释法：不稀释稀释法：不稀释 1/21/21/41/41/81/81/161/16 1/321/321/641/64Ag Ag 1/321/32作为作为AgAg效价效价3.AgAb3.AgAb的亲和力的鉴定的亲和力的鉴定Ag+Ab AgAb KAg+Ab AgAb K值值109-1011L/mol109-1011L/mol之间之间K K值大，值大，AgAbAgAb结合力大结合力大K K值小，值小，AgAbAgAb结合力小结合力小二、抗血清其他鉴定方法：三、抗血清的保存：1.4无菌处理，防腐液体状态3-6月2.-20-40度冰冻保存5年小包装3.干燥冰冻5-10年第四节抗血清中抗体的纯化第四节抗血清中抗体的纯化目的：除去杂目的：除去杂AbAb1.Ab1.Ab特异性的纯化特异性的纯化除去杂除去杂Ab 1Ab 1）吸附剂法）吸附剂法 2 2）亲和层析）亲和层析2.2.特异性特异性IgGIgG抗体的制备：抗体的制备：1 1）盐析法粗提）盐析法粗提V V球蛋白球蛋白不同饱和度的（不同饱和度的（NH4NH4）2SO42SO4或或Na2SO4Na2SO4 2 2）离子交换层析法提取）离子交换层析法提取IgGIgG：常用常用DEAEDEAE纤维素纤维素IgGIgG带正电荷，其他带正电荷，其他propro带负电荷带负电荷 3 3）亲和层析法提取特异性）亲和层析法提取特异性IgGIgG 4 4）酶解法制备）酶解法制备F F（abab）2 2片段片段 第五节 单克隆抗体及基因工程抗体一、单克隆抗体：1、淋巴细胞杂交瘤技术 2、单克隆抗体 3、单克隆与多克隆抗体比较 4、用途二、基因工程抗体一、单克隆抗体 1 1、淋巴细胞杂交瘤技术淋巴细胞杂交瘤技术(kohler milstein)(kohler milstein)淋巴细胞杂交瘤技术：淋巴细胞杂交瘤技术：7575年才创立的技术，将在体外不能年才创立的技术，将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合产生杂交瘤细胞，所得杂交瘤细胞聚乙二醇的作用下融合产生杂交瘤细胞，所得杂交瘤细胞继承了两种细胞的能力，即保存了瘤细胞在体外迅速增殖继承了两种细胞的能力，即保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力，又继承了免疫细胞合成与分化的能力，淋巴传代的能力，又继承了免疫细胞合成与分化的能力，淋巴细胞主要细胞主要 T T细胞、细胞、B B细胞细胞(T(T细胞与胸腺瘤细胞融合，可产细胞与胸腺瘤细胞融合，可产生分泌淋巴因子的生分泌淋巴因子的T T细胞杂交瘤细胞杂交瘤)B)B细胞与细胞与 瘤细胞融合，产瘤细胞融合，产生能分泌特异抗体的生能分泌特异抗体的B B细胞杂交瘤。细胞杂交瘤。2、单克隆抗体：通过淋巴细胞杂交瘤技术，把产生特定抗体的B细胞与能无限生长的骨髓瘤的细胞融合，形成的B细胞杂交瘤，由这克隆化B的 杂交瘤所产生的抗体。纯度高，专一性强，重复性好，且能持续在动物体外或体内产生固体性抗体。3、单、多克隆抗体比较：多克隆抗体多克隆抗体：是由多个淋巴细胞克隆产生的：是由多个淋巴细胞克隆产生的(抗原分子量大，表面决定簇多产生不抗原分子量大，表面决定簇多产生不 抗体抗体)是高是高度异质性，特异性低，纯度差，反应不够灵敏，度异质性，特异性低，纯度差，反应不够灵敏，限制免疫学血清学的发展，影响诊断准确性和治限制免疫学血清学的发展，影响诊断准确性和治疗效果。疗效果。单克隆抗体单克隆抗体：特异性强，体外：特异性强，体外 产生，质地产生，质地均一，反应灵敏，工业化生产任何多肽蛋白质特均一，反应灵敏，工业化生产任何多肽蛋白质特别是半抗原均可用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单别是半抗原均可用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体。克隆抗体。4、单克隆抗体的应用：单克隆抗体技术被誉为免疫学的一次革命，是单克隆抗体技术被誉为免疫学的一次革命，是2020世纪后世纪后2020年年内最为重要的生物高技术之一。内最为重要的生物高技术之一。19841984年获诺贝尔医学与生理年获诺贝尔医学与生理学奖。从医、农、食品等给人带来新的希望。学奖。从医、农、食品等给人带来新的希望。多克隆抗体特异性低，纯度差，反应不够灵敏，影响诊断多克隆抗体特异性低，纯度差，反应不够灵敏，影响诊断的准确性，及治疗效果，以及实验技术的提高，还出现血清的准确性，及治疗效果，以及实验技术的提高，还出现血清病，过敏性休克，含量不一，无法标准化。病，过敏性休克，含量不一，无法标准化。单克隆抗体特异性高，滴度高，质地均一，反应灵敏，可单克隆抗体特异性高，滴度高，质地均一，反应灵敏，可标准化等优点，可工业化大规模生产，单克隆产品诊断试剂标准化等优点，可工业化大规模生产，单克隆产品诊断试剂投资少，收效快，产值高。任何多肽与蛋白如病毒、细菌、投资少，收效快，产值高。任何多肽与蛋白如病毒、细菌、寄生虫，正常细胞及恶化细胞，各种因子受体与介质、激素、寄生虫，正常细胞及恶化细胞，各种因子受体与介质、激素、酶类和血液成份，食物品与环境的有害物，甚至一段氨基酸、酶类和血液成份，食物品与环境的有害物，甚至一段氨基酸、核苷酸核苷酸DNA or RNADNA or RNA顺序化合物半抗原，都可通过顺序化合物半抗原，都可通过B B细胞杂交细胞杂交瘤技术，制备出相应单克隆抗体。瘤技术，制备出相应单克隆抗体。开发癌瘤、病毒性疾病、化脓性疾病、自身免疫疾病和移植排斥反应的单抗新药，广泛应用基础研究、疾病诊断、环境、食品监测，治疗、预防提纯蛋白，优生优育等，主要应用以下几方面：（1）疾病诊断 （2）体内显象定位检查 （3）体内治疗和导向治疗 （4）食品环境监测 （5）提纯蛋白与基因工程产品，用于人、动、植物各学科的分子生物学研究5.单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）抗原决定簇：Ag上特异的化学基因称Ag决定簇。当Ag免疫动物时，Ag的每个抗原决定簇可分别刺激相应B cell，因为每个Bcell表面的Ag受体只针对一个Ag决定簇，并产生针对该Ag决定簇的Ab。一个Bcell只识别一个Ag决定簇，并产生该Ag决定簇的Ab，称为单克隆Ab。这种Ab是均一的，且是单一特异性的。1 种Ag可有多个抗原决定簇第一节第一节B淋巴细胞杂交瘤技术的原理淋巴细胞杂交瘤技术的原理B B淋巴细胞杂交瘤：淋巴细胞杂交瘤：用人工方法使用人工方法使AbAb产生产生cellcell与骨髓瘤与骨髓瘤cellcell融合而成，融合而成，产生的一类特殊产生的一类特殊cellcell。AbAb产生产生cellcell来源于小鼠脾来源于小鼠脾cellcell（B B细胞）细胞）骨髓瘤骨髓瘤cellcell来源于同系小鼠。可大量体外增殖，来源于同系小鼠。可大量体外增殖，长期培养长期培养杂交瘤杂交瘤cellcell兼有两种亲本兼有两种亲本cellcell特性，既能分泌特性，既能分泌AbAb，又能大量增殖，又能大量增殖一、一、BcellBcell杂交瘤技术的原理：杂交瘤技术的原理：二、小鼠骨髓瘤二、小鼠骨髓瘤cellcell的筛选：的筛选：三、细胞融合剂：三、细胞融合剂：PEGPEG多选分子量多选分子量1000-20001000-2000 PEG PEG的作用基理：的作用基理：PEGPEG可改变可改变cellcell膜脂类分子排布，膜脂类分子排布，使使cellcell膜易脂类分子排布，使膜易脂类分子排布，使cellcell膜易被打开，最膜易被打开，最终引起终引起cellcell融合融合HAT培养基的选择作用：HAT 次黄嘌呤（H）核苷酸前体，使cell通过替代途径合成DNA氨基蝶呤（A）叶酸拮抗物，阻断cell合成DNA的主要途径胸腺嘧啶核苷（T）使cell通过替代途径合成DNAcell合成DNA有两种途径：主要途径：糖、主要途径：糖、aaaa、合成核苷酸合成、合成核苷酸合成DNADNA 需叶酸参与氨基蝶呤（需叶酸参与氨基蝶呤（A A）可阻）可阻替代途径：次黄嘌呤（替代途径：次黄嘌呤（H H）、胸腺嘧啶核苷（）、胸腺嘧啶核苷（T T）HGPRTHGPRTTKTK催化催化小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤cellcell都缺乏都缺乏HGPRTHGPRT，在，在HATHAT培养基中，培养基中，不能完成完整不能完成完整DNADNA合成过程合成过程 易死亡易死亡杂交瘤杂交瘤cellcell可利用脾可利用脾C C的的HGPRTHGPRT，通过替代途径，通过替代途径合成合成DNADNA杂交瘤cell的筛选和克隆化 1.1.筛选目的：筛选目的：AbAb阳性分泌的杂交瘤细胞，阳性分泌的杂交瘤细胞，ELISAELISA：检测：检测Ab AbAb Ab阳阳性细胞性细胞纯化好的单一性可溶性纯化好的单一性可溶性AgAg，包被到微孔上，包被到微孔上2.2.杂交瘤的克隆化：杂交瘤的克隆化：2.12.1定义：用一定方法使混合的定义：用一定方法使混合的cellcell分离成单个分离成单个cellcell独立状态，再经扩独立状态，再经扩大培养形成的各个大培养形成的各个cellcell群，就分别是一个克隆，这种方法称为克群，就分别是一个克隆，这种方法称为克隆化隆化2.22.2目的：获得目的目的：获得目的AbAb阳性，阳性，AbAb分泌旺盛的杂交瘤分泌旺盛的杂交瘤cellcell株株2.32.3克隆化方法：有限稀释法将融合克隆化方法：有限稀释法将融合cellcell用培养液充分稀释，直至每用培养液充分稀释，直至每 孔只有孔只有1 1个个cellcell 显微操作法显微操作法 琼脂平板法琼脂平板法 细胞选分代法细胞选分代法2.42.4再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要检测再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要检测AbAb多次传代，多次传代，冰冻复苏的杂交瘤冰冻复苏的杂交瘤cellcell均要再次克隆化均要再次克隆化第二节制备第二节制备McAb的技术要点的技术要点一、免疫小鼠：一、免疫小鼠：为防止免疫反应不佳或中途死亡，应同时免疫为防止免疫反应不佳或中途死亡，应同时免疫3-43-4只小鼠只小鼠AgAg纯纯选用与骨髓瘤选用与骨髓瘤cellcell同源的同源的BALB/CBALB/C小鼠小鼠二、培养骨髓瘤二、培养骨髓瘤cellcell：与待融合脾与待融合脾cellcell同源同源选生长旺盛，形态良好，处于对数生长期的选生长旺盛，形态良好，处于对数生长期的cellcell以供融合用以供融合用避免避免cellcell反祖，用反祖，用8-AG8-AG处理处理cellcell切忌过多传代切忌过多传代三、收集脾三、收集脾cellcell分离脾之前，要检测分离脾之前，要检测AbAb。采脾，制成悬液。采脾，制成悬液四、采取饲养四、采取饲养cellcell五、五、cellcell融合：融合：是杂交瘤的中心环节，是杂交瘤的中心环节，PEGPEG融合融合六、检测六、检测AbAbAbAb检测结果检测结果+阳性阳性cellcell克隆化克隆化 -更换动物，避免无效试验更换动物，避免无效试验检测检测AbAb，一般选用，一般选用ELISAELISA或或RIARIA（放免）（放免）目的：找到阳性细胞株目的：找到阳性细胞株七、单个细胞培养七、单个细胞培养八、制备八、制备McAbMcAb九、阳性细胞的冻存和复苏九、阳性细胞的冻存和复苏十、十、McAbMcAb的纯化的纯化盐析法粗提半饱和硫酸铵沉淀盐析法粗提半饱和硫酸铵沉淀进一步纯化进一步纯化 根据根据McAbMcAb性质层析离子交换层析性质层析离子交换层析IgGIgG 亲和层析亲和层析IgGIgG、IgMIgM十一、McAb的鉴定1.Ig1.Ig类型测定类型测定2.2.特异性测定特异性测定3.3.抗体效价测定抗体效价测定4.4.决定簇测定决定簇测定5.5.亲和性测定亲和性测定K KK1/K2K1/K2K K：109-1011L/mol109-1011L/mol二、基因工程抗体：自自8080年代起开始了基因工程抗体年代起开始了基因工程抗体(genetic engineering(genetic engineering antibody)antibody)的研究工作。的研究工作。制备基因工程抗体的基本过程首先是获得抗体的基因制备基因工程抗体的基本过程首先是获得抗体的基因片段，可从片段，可从B B细胞细胞DNADNA库中筛选；用探针从杂交瘤细胞、库中筛选；用探针从杂交瘤细胞、免疫脾细胞的免疫脾细胞的DNADNA库中或库中或cDNAcDNA库中筛选，或以库中筛选，或以PCRPCR法法直接扩增等。然后将抗体基因片段导入真核细胞直接扩增等。然后将抗体基因片段导入真核细胞(如杂如杂交瘤细胞交瘤细胞)或原核细胞或原核细胞(如大肠杆菌等如大肠杆菌等)，使之表达具有，使之表达具有功能活性的抗体片段。功能活性的抗体片段。目前已获表达产物的重组抗体主要有以下几种类型。目前已获表达产物的重组抗体主要有以下几种类型。1、嵌合抗体(chimeric antibody)将小鼠VH基因与人CH基因(1或2重莲)连接后导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链。再将小鼠杂交瘤细胞的VL与人CL基因相连，转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞，经过筛选，得到能分泌人鼠嵌合抗体的骨髓瘤细胞，其所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分泌的抗体特异性及亲和力相同，但减少了其中的鼠源性成分。基因工程技术制备McAb2、重构型抗体为进一步减少抗体蛋白中鼠源性成分的比例，可将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab段骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。3、单链抗体将抗体VL羧基端基因序列与VH氨基端基因序列连接成单链的抗体V区基因，将它转入大肠杆菌使之表达能与抗原结合的单链抗体。此抗体之优点是分子量很小，作为异种蛋白的免疫原性较弱，用于肿瘤导向治疗时易渗透入实体瘤内部，其缺点是此类抗体无重链稳定区，故不能介导抗体的其他效应功能。4、抗体库：即用基因克隆技术将全套抗体(repertoire)重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过在大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，筛选特异性的可变区基因。为第三代抗体，标志抗体技术发展的质的飞跃，从细胞工程抗体发展到基因工程抗体。