第四章蛋白质.pptx

l18781878年，思格斯就在年，思格斯就在反杜林论反杜林论中指出：中指出：“生命是蛋白体的生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。部分的不断的自我更新。”l第一，蛋白体是生命的物质基础；第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。科学发展完全证明科学发展完全证明该结论。生命科学重要发展方向之一：该结论。生命科学重要发展方向之一：蛋白质组学蛋白质组学l功能：功能：酶催化、调节、转运、贮存、运动、结构、保护和进酶催化、调节、转运、贮存、运动、结构、保护和进攻、异常功能（吸附弹性）等。攻、异常功能（吸附弹性）等。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质App 1App 1：Vital Bio-function of PNVital Bio-function of PN附：附：Proteomics1994年，澳大利亚学者年，澳大利亚学者 M.Wilkins&K.Williams首先提首先提出出“蛋白组蛋白组”概念概念细胞内基因组表达的所有蛋白质细胞内基因组表达的所有蛋白质。蛋白组学蛋白组学：在整体水平上研究细胞内蛋白质组分及其活：在整体水平上研究细胞内蛋白质组分及其活动规律的新学科；包括：动规律的新学科；包括：蛋白质的组成、结构、功能、蛋白质的组成、结构、功能、生物合成、调节控制及其相互之间的关系生物合成、调节控制及其相互之间的关系等内容。等内容。其基础紧密依赖于其基础紧密依赖于“基因组学基因组学”、“功能基因组学功能基因组学”或或“结构基因组学结构基因组学”、“RNA基因组学基因组学”或或“核糖核酸组学核糖核酸组学”、“生物信息学生物信息学”等等“后基因组学后基因组学”的进展。的进展。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质App 2App 2：Composing of PNComposing of PN蛋白质是一类含氮有机化合物：蛋白质是一类含氮有机化合物：l碳：碳：5050l氢：氢：7 7l氧：氧：2323l氮：氮：16%16%，凯氏定氮的计算基础，凯氏定氮的计算基础，6.256.25l硫：硫：0-30-3l其他：其他：微量，金属元素等。微量，金属元素等。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质App 3App 3：Classification of PNClassification of PNl按照蛋白质的组成，可以分为按照蛋白质的组成，可以分为lsimple protein simple protein lconjugated protein:prosthetic group or ligandconjugated protein:prosthetic group or ligandl按照蛋白质的分子形状，可以分为按照蛋白质的分子形状，可以分为lfibrous proteinfibrous proteinlglobal proteinglobal protein研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质eg1eg1：simple PNsimple PNl又称为单纯蛋白质又称为单纯蛋白质,这类蛋白质只含由这类蛋白质只含由-氨基酸组成氨基酸组成的的肽链肽链，不含其它成分。不含其它成分。清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白albumin and globulinalbumin and globulin：广泛存在于：广泛存在于动物动物组织组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。谷蛋白谷蛋白(glutelin)(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin)(prolamin)：植物蛋白，不溶植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70708080乙醇中。乙醇中。精蛋白和组蛋白：精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。碱性蛋白质，存在与细胞核中。硬蛋白：硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝心蛋白。蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝心蛋白。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质eg2:eg2:conjugated PNconjugated PNl由由简单蛋白简单蛋白与其它与其它非蛋白成分非蛋白成分结合而成，又称缀合蛋白。结合而成，又称缀合蛋白。色蛋白：色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白血红蛋白、叶绿叶绿蛋白蛋白和和细胞色素细胞色素等。等。糖蛋白：糖蛋白：简单蛋白与糖类物质组成，如细胞膜中的糖蛋白等。简单蛋白与糖类物质组成，如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。由简单蛋白与脂类结合而成。如血浆脂蛋白如血浆脂蛋白 (-，-脂蛋白等脂蛋白等)。核蛋白：核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。白等。金属蛋白：金属蛋白：铁蛋白铁蛋白/Fe/Fe，乙醇脱氢酶，乙醇脱氢酶/Zn/Zn，细胞色素，细胞色素C/Cu,FeC/Cu,Fe研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l氨基酸氨基酸l蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构l蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构l蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系l蛋白质的分离、纯化与测定蛋白质的分离、纯化与测定Content研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l氨基酸的制取氨基酸的制取l氨基酸的种类氨基酸的种类l氨基酸的两性电离氨基酸的两性电离l氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质l氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸的光学活性和光谱性质1、Amino acid研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质（1 1）氨基酸的制取）氨基酸的制取酸水解：酸水解：6M 6M 盐酸或盐酸或 4M 4M 硫酸，硫酸，105-110105-110，回流，回流20hr20hr；不水旋，但破坏色氨酸、羟基氨酸、天冬不水旋，但破坏色氨酸、羟基氨酸、天冬酰胺酰胺和谷氨酸和谷氨酸碱水解：碱水解：5M 5M 氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时小时,破坏性并消旋；破坏性并消旋；酶水解酶水解:多种多种ProteinaseProteinase协同水解，常温中性。协同水解，常温中性。三者的三者的区别？区别？研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质T Trypsin rypsin：R1=R1=赖氨酸赖氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg侧链侧链专一性较强，水解快专一性较强，水解快研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质糜蛋白酶或糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶（C Chymotrypsinhymotrypsin）：）：R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，蛋氨酸蛋氨酸MetMet和和组氨酸组氨酸HisHis水解稍慢水解稍慢。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质lP Pepsinepsin：R1R1和和R2R2R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮亮氨酸氨酸LeuLeu以及其以及其它疏水性氨基酸它疏水性氨基酸水解速度较快。水解速度较快。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l羧肽酶和氨羧肽酶和氨肽酶：肽酶：分别分别从肽链羧基从肽链羧基端和氨基端端和氨基端水解水解研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 嗜热蛋白酶嗜热蛋白酶 thermolysinthermolysin：R2=R2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸TyrTyr；亮亮氨酸氨酸LeuLeu，异亮氨酸，异亮氨酸Ileu,Ileu,蛋氨酸蛋氨酸MetMet以及其它疏水性以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。强的氨基酸水解速度较快。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l蛋白质氨基酸：蛋白质氨基酸：20种，常见氨基酸，均为种，常见氨基酸，均为 a-L-AA；l非蛋白质氨基酸：非蛋白质氨基酸：160种，不常见氨基酸，有种，不常见氨基酸，有/-L/DL/D-AAAA。l必需氨基酸：必需氨基酸：人体不能合成，需要从饮食中摄取的。人体不能合成，需要从饮食中摄取的。l分类：分类：脂肪族脂肪族（中性中性/酸性酸性 及酰胺及酰胺/碱性碱性）、）、芳香族芳香族杂环族杂环族（非极性非极性/不荷电不荷电R基基/荷正电荷正电/荷负电荷负电 氨基氨基酸酸）；）；（2 2）氨基酸的种类）氨基酸的种类研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质20种氨基酸种氨基酸1研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质丝半胱苏丝半胱苏20种氨基酸种氨基酸2研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质苯丙酪色苯丙酪色组赖精组赖精l这这些些氨氨基基酸酸都都是是由由相相应应的的基基本本氨氨基基酸酸衍衍生生而而来来的的。其其中中重重要要的的有有4-4-羟羟基基脯脯氨氨酸酸、5-5-羟羟基基赖赖氨氨酸酸、N-N-甲甲基基赖赖氨氨酸酸、和和3,5-3,5-二二碘碘酪酪氨氨酸等。酸等。附：几种重要的不常见氨基酸附：几种重要的不常见氨基酸研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l氨氨基基酸酸晶晶体体高高熔熔点点（200200），水水溶溶液液的的高高介介电电和和缓缓冲特性？冲特性？l在不同的在不同的pHpH条件下，两性离子的状态也随之发生变化条件下，两性离子的状态也随之发生变化COO-CHH3N+RCOOHCHH3N+RCOO-CHH2NRPH:1 7 10净电荷净电荷+1 0 -1 A+A0（兼性离子）（兼性离子）A-等电点等电点 PI（3 3）氨基酸的两性电离）氨基酸的两性电离研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l当当溶溶液液处处于于某某一一pHpH值值时时，氨氨基基酸酸分分子子中中所所含含的的 -NH-NH3 3+和和 -COO-COO-数数目目正正好好相相等等，净净电电荷荷为为 0 0，该该pHpH值值为为 p pI I。在在等等电电点点时时，氨氨基基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。l侧侧链链不不含含离离解解基基团团的的中中性性氨氨基基酸酸，其其等等电电点点是是它它的的 p pK K1 1 和和 p pK K2 2 的算术平均值：的算术平均值：p pI I =(p(pK K1 1+p+pK K2 2)/2)/2 l对对于于侧侧链链含含有有可可解解离离基基团团的的氨氨基基酸酸（多多氨氨基基和和多多羧羧基基），p pI I值值也决定于也决定于两性离子两边两性离子两边p pK K值的算术平均值值的算术平均值：酸性氨基酸：酸性氨基酸：p pI I =(p(pK K1 1+p+pK KR-COOR-COO-)/2)/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：p pI I =(p(pK K2 2+p+pK KR-NH2 R-NH2)/2)/2 附：等电点附：等电点PIPI及其计算及其计算研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质lPI PI 值计算公式的推导方法？值计算公式的推导方法？l为什么氨基酸的滴定曲线（解离曲线）出现多个拐点？为什么氨基酸的滴定曲线（解离曲线）出现多个拐点？l为为什什么么苷苷氨氨酸酸的的a-COOH a-COOH 的的酸酸性性比比醋醋酸酸的的强强？（a-NHa-NH2 2 和和 COOH COOH 相互的场强效应）相互的场强效应）l氨氨基基酸酸甲甲醛醛滴滴定定的的原原理理是是什什么么？（降降低低 NHNH2 2碱碱性性，缩缩小小PIPI范围）范围）附：思考与讨论附：思考与讨论研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质板书详细讨论化学反应方程式：板书详细讨论化学反应方程式：P135-143P135-143la-NHa-NH2 2：氧化：氧化：HNOHNO2 2，H H2 2SOSO4 4（凯氏定氮原理凯氏定氮原理）；）；烃基化：烃基化：DNFPDNFP（黄色黄色），），PITCPITC；酰化：酰化：DNSDNS（荧光荧光），），CBCCBC（苄甲酰氯）；（苄甲酰氯）；脱脱氨氨；形成西佛碱：形成西佛碱：与醛类生成与醛类生成 schiffs baseschiffs base，转氨基反应的转氨基反应的中间体中间体 l-COOH-COOH：酰化酰化（PClPCl5 5活化）；活化）；脱羧脱羧；成酯成酯；叠氮反应：叠氮反应：NHNH2 2NHNH2 2，固固定定C C端。端。lHNCR-COOHHNCR-COOH：水合茚三酮的显色；成肽；水合茚三酮的显色；成肽；l侧链反应：侧链反应：其它其它l如何应用这些性质进行氨基酸的分析和鉴定？如何应用这些性质进行氨基酸的分析和鉴定？（4 4）氨基酸的化学性质）氨基酸的化学性质研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质附：成肽反应附：成肽反应研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 （5 5）氨基酸的光学活性和光谱性质）氨基酸的光学活性和光谱性质l光学活性：光学活性：除甘氨酸外，氨基酸均含有除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性一个手性-碳原子碳原子，都具，都具有有旋光性旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据基酸的重要依据 研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质构成蛋白质的构成蛋白质的20AA20AA在可见光区在可见光区都没有光吸收，但在都没有光吸收，但在远紫外区远紫外区(220nm97%97%以上）；以上）；l知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；l知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；l测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。基酸的个数。l测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。A A、PreparingPreparing研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l构成蛋白质的多肽链数目的测定构成蛋白质的多肽链数目的测定l拆分多肽链成单链拆分多肽链成单链l测定（每条）单链的氨基酸组成测定（每条）单链的氨基酸组成l分析单链的分析单链的N末端和末端和C末端末端l断裂单链中的二硫键断裂单链中的二硫键l降解单链成为肽段降解单链成为肽段l测定各肽段的氨基酸组成和顺序测定各肽段的氨基酸组成和顺序l确定肽段在原单链中的位置确定肽段在原单链中的位置l确定原单链中的二硫键位置确定原单链中的二硫键位置l确定原蛋白质的多肽链组成确定原蛋白质的多肽链组成B B、sequencing proceduresequencing procedure研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 通过测定通过测定末端氨基酸残基末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。的关系，即可确定多肽链的数目。方法？方法？1 1、多肽链数目的测定、多肽链数目的测定研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍盐酸胍处理，即可分开多肽链处理，即可分开多肽链(亚基亚基)。2 2、多肽链的拆分、多肽链的拆分研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质3 3、测定单链氨基酸组成、测定单链氨基酸组成 完全降解单链成氨基酸完全降解单链成氨基酸，再，再测定氨基酸组成测定氨基酸组成（HPLCHPLC，TLCTLC），并，并计算出氨基酸成分的分子比；计算出氨基酸成分的分子比；研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析端氨基酸分析法。法。l二硝基氟苯法二硝基氟苯法l丹磺酰氯法丹磺酰氯法l氨肽酶法氨肽酶法l肼解法肼解法l羧肽酶法羧肽酶法4 4、确定单链的、确定单链的N N末端和末端和C C末端末端研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 Sanger Sanger法：法：碱性条件下碱性条件下，DNFBDNFB能够与肽链能够与肽链N-N-端的游离氨基端的游离氨基作用生作用生成二成二硝基苯衍生物（硝基苯衍生物（DNPDNP）；在；在酸性条件酸性条件下水解，得到下水解，得到黄色黄色DNP-DNP-氨氨基酸基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱氨基酸可以用色谱法进行鉴定。法进行鉴定。二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 在在碱性条件碱性条件下，下，DNSDNS（二甲氨基萘磺酰氯）可以与（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的端氨基酸的游离氨基游离氨基作用，得到作用，得到丹磺酰丹磺酰-氨基酸氨基酸；此法的优点是丹磺酰；此法的优点是丹磺酰-氨基酸有氨基酸有很强的荧光性质很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽与肼在。多肽与肼在无水条件下加热无水条件下加热，C-C-端端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。肼解法肼解法研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质lAmino peptidase:Amino peptidase:exopeptidase exopeptidase，它能从多肽链的，它能从多肽链的N-N-端端逐个的向里水解逐个的向里水解，释放出，释放出AAAA。l根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，动力学曲线，从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序末端残基顺序。l最常用的氨肽酶是最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶 leucine amino leucine amino pepetidasepepetidase，亮氨酸残基为，亮氨酸残基为N-N-末端的肽键水解速度最大末端的肽键水解速度最大 氨肽酶法氨肽酶法研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质lCarboxpeptidase:Carboxpeptidase:exopeptidase exopeptidase，它能从多肽链的，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解。端逐个的水解。l根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的和数量，从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。l目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水只能水解解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。羧肽酶法羧肽酶法研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质5 5、断裂单链中的二硫键、断裂单链中的二硫键l首先加入首先加入6M6M盐酸胍（或盐酸胍（或 8M Urea8M Urea）等解离多肽链之间的非共价力）等解离多肽链之间的非共价力（denaturedenature），再用），再用过甲酸氧化法过甲酸氧化法或或巯基还原法巯基还原法（巯基乙醇）（巯基乙醇）拆分多拆分多肽链间的二硫键肽链间的二硫键。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质上述上述这些反应可用于巯基的保护，防止这些反应可用于巯基的保护，防止SHSH被重新氧化被重新氧化。断裂二硫键生成的巯基保护断裂二硫键生成的巯基保护研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l肽链选择性地被降解断裂成多个肽段，可采用肽链选择性地被降解断裂成多个肽段，可采用两种或多种两种或多种不同不同的断裂方法的断裂方法，将蛋白质或多肽断裂成将蛋白质或多肽断裂成两套或多套两套或多套肽段肽段或肽碎片，并将其分离开来。或肽碎片，并将其分离开来。l酶促降解法和化学降解法：酶促降解法和化学降解法：酶解法酶解法（proteinaseproteinase）：）：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶（P173-174P173-174）化学法化学法(Cyanogen bromide)：溴化氰水解法，它能选择性溴化氰水解法，它能选择性地切割由地切割由甲硫氨酸的羧基甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。所形成的肽键。6 6、降解单肽链为肽段、降解单肽链为肽段研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质C H3S：C H2C H2C HN HCN HC HCOOR+B rC+NB r-C H3S+C H2C H2C HN HCN HC HCOORCNC H3SCNC H2C HN HCN HC HCOORC H2+H2O+C H2C HN HCOC H2OH3N+C HCOR高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯化学溴化氰水解法化学溴化氰水解法甲硫氨酸甲硫氨酸研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质 附：肽段分析附：肽段分析见见Flash:Flash:肽段拆分肽段拆分研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质7 7、测定单肽链的氨基酸组成、测定单肽链的氨基酸组成lEdman degradationEdman degradation（PITCPITC）：氨基酸顺序分析法实际上也是一种：氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸端氨基酸残基逐一残基逐一 生成生成 PTH-AA PTH-AA 进行标记和解离。进行标记和解离。见见Flash:EdmanFlash:Edman研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质偶偶 联联环化断裂环化断裂分离检测分离检测转化转化l利用利用两套或多套肽段两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的的氨基酸顺序彼此间的交错重叠交错重叠，拼凑拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。出整条多肽链的氨基酸顺序。8 8、确定肽段在肽链中的顺序、确定肽段在肽链中的顺序l见：见：Flash Flash 肽段拼接肽段拼接研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质9 9、确定肽链中二硫键的位置、确定肽链中二硫键的位置l一般采用一般采用胃蛋白酶胃蛋白酶处理没有处理没有断开二硫键的多肽链。断开二硫键的多肽链。为何为何选取选取 pepsin?l再利用再利用双向电泳技术双向电泳技术（diagonal electrophoresis）分离出含二硫键的肽段。分离出含二硫键的肽段。l然后同其它方法分析的肽段然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键位置进行比较，确定二硫键位置S-S双向正交电泳示意双向正交电泳示意研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质过甲酸熏蒸过甲酸熏蒸l同源蛋白（同源蛋白（homology PNhomology PN ）与生物进化（）与生物进化（phylogenetic phylogenetic tree&divergencetree&divergence）研究：）研究：variable residue and variable residue and invariable residue,sequence homology.invariable residue,sequence homology.l l血液凝固机理：血液凝固机理：血液凝固机理：血液凝固机理：cascade amplication(cascade amplication(酶促激活级联放大酶促激活级联放大)：zymogen 12 clotting factorzymogen 12 clotting factor经激活后经激活后水解血纤蛋水解血纤蛋白原白原凝集成血纤蛋白凝块（凝集成血纤蛋白凝块（clotclot）；）；l血纤蛋白溶解系统：血纤蛋白溶解系统：酶原激活剂酶原激活剂激活纤维酶原激活纤维酶原水解血水解血纤蛋白纤蛋白；血栓（血栓（thrombusthrombus）(3)(3)Linkage between Primary structure&bio-function研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l肽人工合成的方法：肽人工合成的方法：AA聚合或共聚合反应；人工控制合成法；聚合或共聚合反应；人工控制合成法；l固相肽合成技术（固相肽合成技术（solid-phase peptide synthesis）：）：始于始于1960s，对分子生物学和基因工程研究具有重大影响和意义。，对分子生物学和基因工程研究具有重大影响和意义。Peptide synthesizer，一般由一般由C端至端至N端合成。端合成。l1965年，中年，中国王应睐、曹天钦、邹承鲁、王德宝、钮经义、汪国王应睐、曹天钦、邹承鲁、王德宝、钮经义、汪猷、邢其毅，猷、邢其毅，化学法合成化学法合成结晶牛胰岛素结晶牛胰岛素，纯度，纯度50%（A chain N-9 peptide+C-12 peptide composed with B chain 8 peptide+22 peptide）。）。(4)(4)Synthesis of Peptide&PN研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l1963年，年，R.B.Merrifiel 创立了将氨基酸的创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法。在固相法中，的固相合成法。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的，克服了经典液相合成法中的每一步产物都需便可达到纯化目的，克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础。为此，纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础。为此，Merrifield获得获得1984年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。l今天，固相法得到了很大发展今天，固相法得到了很大发展.除了除了 Merrifield 所建立的所建立的 Boc solid-phase synthesis（Boc：叔丁氧羰基）之外，又发展了：叔丁氧羰基）之外，又发展了Fmoc solid-phase synthesis（Fmoc：9-芴甲氧羰基）。以这两种方法为芴甲氧羰基）。以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善造和完善.研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质APP:Procedure of Fmoc.Method研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质(1)C末端氨基酸与树脂末端氨基酸与树脂结合结合(2)Na-Fmoc的脱除、洗的脱除、洗涤涤(3)耦联、洗涤耦联、洗涤(4)重复重复(2)(3)步步(5)脱保护基脱保护基 l载体：载体：聚聚苯乙烯苯乙烯-苯二乙烯交联树脂苯二乙烯交联树脂是多肽合成中最早、最常用的固是多肽合成中最早、最常用的固相载体树脂是有机聚合物，在反应基团（接头）导入前的叫相载体树脂是有机聚合物，在反应基团（接头）导入前的叫树脂树脂，导入，导入接头后则叫接头后则叫载体载体，但通常不用严格区分，可笼统使用。，但通常不用严格区分，可笼统使用。为为D20-150m 小球，小球，PS交联度交联度1-20%。A A、CarrierCarrier研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l接头导入：接头导入：上面的聚合物是起支撑和载带作用，并不能直接连上面的聚合物是起支撑和载带作用，并不能直接连上（第一个）氨基酸，必须要在苯环上导入反应基团（接头）。上（第一个）氨基酸，必须要在苯环上导入反应基团（接头）。最简单而最常用的基团是氯甲基。它可以通过一个最简单而最常用的基团是氯甲基。它可以通过一个傅氏反应傅氏反应导入导入B B、AdapterAdapter研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l挂起：挂起：先将待挂起的先将待挂起的 AA 的的-NH2进行进行 N-保护，再保护，再通过氨基酸的羟基反应形成苄酯的结构而把起始氨基通过氨基酸的羟基反应形成苄酯的结构而把起始氨基酸挂到树脂上。酸挂到树脂上。C C、LinkageLinkage研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力l蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构l纤维状蛋白质纤维状蛋白质l超二级结构和结构域超二级结构和结构域l球状蛋白与三级结构球状蛋白与三级结构l蛋白质的折叠和结构预测蛋白质的折叠和结构预测l亚缔合和蛋白质的四级结构亚缔合和蛋白质的四级结构3 3、蛋白质的三维结构、蛋白质的三维结构研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质（1）稳定蛋白质三维结构的作用力）稳定蛋白质三维结构的作用力研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l非共价键：非共价键：氢键、范德华力、疏水作用、盐键氢键、范德华力、疏水作用、盐键l共价键：共价键：二硫键二硫键附附1 1：共价键：共价键l蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。l是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键核酸）构成共价键l共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。制作用。研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l生生物物体体系系中中分分子子识识别别的的过过程程不不仅仅涉涉及及到到化化学学键键的的形形成成，而而且且具具有有选选择择性性的的识识别别。共共价价键键存存在在于于一一个个分分子子或或多多个个分分子子的的原原子子之之间间，决决定定分分子子的的基基本本结结构构，是分子识别的一种方式。是分子识别的一种方式。l非非共共价价键键（又又称称为为次次级级键键或或分分子子间间力力）决决定定生生物物大大分分子子和和分分子子复复合合物物的的高高级级结结构构，在在分分子子识识别别中中起起着着关键的作用。关键的作用。附附2 2：非共价键：非共价键研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l静静电电作作用用是是指指荷荷电电基基团团、偶偶极极以以及及诱诱导导偶偶极极之之间间的的各各种种静电吸引力。静电吸引力。l酶酶、核核酸酸、生生物物膜膜、蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子子的的表表面面都都具具有有可可电电离离的的基基团团和和偶偶极极基基团团存存在在，很很容容易易与与含含有有极极性性基基团团的的底物或抑制剂底物或抑制剂等生成离子键和其它静电作用等生成离子键和其它静电作用附附3 3：静电作用：静电作用研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l属荷电不同属荷电不同正负离子或基团间正负离子或基团间的普遍性静电相互作用。的普遍性静电相互作用。l生生物物大大分分子子表表面面的的带带电电基基团团可可以以与与药药物物或或底底物物分分子子的的带电基团形成离子键，也可以解离。带电基团形成离子键，也可以解离。a.a.静电作用：离子键（盐桥）静电作用：离子键（盐桥）研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l药药物物分分子子和和受受体体分分子子中中O O、S S、N N和和C C原原子子的的电电负负性性均均不不相相等等，这这些些原原子子形形成成的的键键由由于于电电负负性性差差值值可可以以产产生生偶偶极极现现象象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用.l离子离子-偶极相互作用偶极相互作用一般比离子键小得多，一般比离子键小得多，键能与距离的键能与距离的平方差成反比平方差成反比，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会向会影响药物影响药物-受体的作用强度受体的作用强度。如：普鲁卡因及其衍生。如：普鲁卡因及其衍生物的局部麻醉作用与酯羰基的偶极性质有关。物的局部麻醉作用与酯羰基的偶极性质有关。b.b.静电作用：离子偶极作用静电作用：离子偶极作用研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l两两个个原原子子电电负负性性不不同同产产生生价价键键电电子子的的极极化化作作用用，成成为为持持久久的的偶极两个偶极间的作用。偶极两个偶极间的作用。l大大小小取取决决于于偶偶极极的的大大小小、间间距距和和相相互互位位置置。这这种种相相互互作作用用在在水溶液中水溶液中普遍存在。普遍存在。l强强度度比比离离子子偶偶极极作作用用小小，比比偶偶极极诱诱导导偶偶极极作作用用大大。这这种种作作用用对对药药物物受受体体相相互互作作用用的的特异性和立体选择性非常重要特异性和立体选择性非常重要c.c.静电作用：偶极静电作用：偶极偶极相互作用偶极相互作用研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l由两个由两个负电性原子负电性原子对对氢原子氢原子的的静电引力静电引力所形成，是一种所形成，是一种特殊的特殊的偶极偶极偶极键偶极键。l HB HB 键能比键能比共价键弱，比范德华力强，共价键弱，比范德华力强，在生物体系中为在生物体系中为8.48.433.4kJ/mol(2-8kcal/mol),33.4kJ/mol(2-8kcal/mol),键长为键长为0.250.250.31nm0.31nm，比共价键短。氢键的方向用键角表示，比共价键短。氢键的方向用键角表示，X XH H与与H HY Y之之间的夹角一般为间的夹角一般为180180 250250。l在蛋白质中，主要在在蛋白质中，主要在N NH H和和O OH H之间。之间。大多数蛋白质采大多数蛋白质采取的折叠策略是取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的使主链肽基之间形成最大数目的HBHBA A、Hydrogen bondHydrogen bond研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l这这是是一一种种普普遍遍存存在在的的作作用用力力，是是一一个个原原子子的的原原子子核核吸吸引引另另一一个个原原子子外外围围电电子子所所产产生生的的作作用用力力。它它是是一一种种比比较较弱弱的的、非非特特异性异性的作用力。的作用力。l范范德德华华力力包包括括引引力力和和排排斥斥力力，其其中中作作用用势势能能与与1/R1/R6 6成成正正比比，三种作用力（三种作用力（静电力、诱导力和色散力静电力、诱导力和色散力）通称为范德华引力。）通称为范德华引力。l这这种种作作用用力力非非常常依依赖赖原原子子间间的的距距离离，当当相相互互靠靠近近到到大大约约0.40.40.6nm(40.6nm(46A6A)时，这种力就表现出时，这种力就表现出较大的集合性质。较大的集合性质。B B、Ven der Weals forceVen der Weals force研究生生物化学蛋白质研究生生物化学蛋白质l PN PN的水溶液中，的水溶液中，极性基团极性基团间的