中国白酒中四甲基吡嗪的研究进展_刘帮.pdf

DOI：10.13746/j.njkj.2022255基金项目：四川省科技计划项目（2020ZHCG0049）；四川大学泸州市人民政府战略合作项目（2020CDLZ-3）。作者简介：刘帮（1996-），男，贵州铜仁人，本科，助理工程师，主要从事白酒酿造、知识产权等方面的研究。通讯作者：王西(1987-)，男，四川省古蔺县人，本科，高级工程师，主要从事白酒酿造研究。中国白酒中四甲基吡嗪的研究进展刘帮1，2，王西1，2，张亚东1，2，甘浪飞1，2，曾梦圆1（1.四川郎酒股份有限公司，四川 古蔺 646523；2.四川省酱香型白酒生态酿造工程技术研究中心，四川 古蔺 646523）摘要：四甲基吡嗪是一种具有爆米花、坚果和水果特别香味的风味物质，广泛存在于白酒、豆制品、陈醋中。在中国白酒中，其在酱香型白酒中含量尤为突出。本文综述了四甲基吡嗪的理化性质和白酒中四甲基吡嗪的合成、检测方法，概括了近年来四甲基吡嗪在白酒中的研究进展，旨在为提高中国白酒中四甲基吡嗪含量及分析提供参考。关键词：中国白酒；酒曲；四甲基吡嗪中图分类号：TS261.3；TS261.7文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）04-0105-05Research Progress in Tetramethylpyrazine in Chinese BaijiuLIU Bang1,2,WANG Xi1,2,ZHANG Yadong1,2,GAN Langfei1,2and ZENG Mengyuan1(1.Langjiu Distillery Co.Ltd.,Gulin,Sichuan 646523;2.Sichuan Ecological Brewing TechnologyResearch Center for Jiangxiang Baijiu,Gulin,Sichuan 646523,China)Abstract:Tetramethylpyrazine is a flavor substance with the aroma of popcorn,nuts and fruits.Tetramethylpyrazine widely exists inBaijiu,bean products and mature vinegar,especially in Jiangxiang Baijiu.This paper reviews the physicochemical properties of tetra-methylpyrazine,the synthesis of tetramethylpyrazine in Baijiu,and the detection methods of tetramethylpyrazine in Baijiu.The re-search progress in tetramethylpyrazine in Baijiu in recent years is summarized,so as to provide reference for the analysis and im-provement of the content of tetramethylpyrazine in Baijiu.Key words:Chinese Baijiu;Jiuqu;tetramethylpyrazine四甲基吡嗪（2,3,5,6-Tetramethylpyrazine,TT-MP），化学名为2,3,5,6-四甲基吡嗪，又名川芎嗪，存在于白酒、大豆制品、咖啡、乳制品等产品中，有类似于爆米花、坚果和水果的特别香味，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚的作用。经研究，以四甲基吡嗪等为原料合成的衍生物，对人神经母瘤细胞和肝癌细胞的增殖起着抑制作用1。四甲基吡嗪还可通过调控NF-B和MAPK等信号通路降低人体内幽门螺杆菌代谢物，对引起的炎症有抑制作用，具有一定的抗炎活性，是白酒中重要的健康功能因子2。四甲基吡嗪在白酒中产生的主要途径是微生物的代谢反应3，生产工艺的差异导致各香型白酒中四甲基吡嗪含量存在差异。据文献报道，四甲基吡嗪含量在酱香型白酒中最高，芝麻香、浓香型白酒次之，清香型白酒中最低4-5，独特的堆积糖化工艺是酱香型白酒和芝麻香型白酒中四甲基吡嗪含量较高的主要原因。1四甲基吡嗪的性质与检测1.1四甲基吡嗪性质四 甲 基 吡 嗪 分 子 式 为 C8H12N2，密 度 1.08103kg/m3，熔点8286，沸点190，纯物质状态下呈白色晶体或粉末状，其结构是（见图1）含两个氮杂原子的六元杂环化合物，因此具有与吡啶类似的气味、芳香性。从杂化轨道理论角度而言，四甲酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)105105酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)基吡嗪杂氮原子上未共用电子对不参与大体系的形成，同时由于氮的电负性比碳大，造成杂环上电子云密度较低，最终导致四甲基吡嗪极不容易发生亲电取代反应。1.2四甲基吡嗪检测技术利用气相色谱技术、液相色谱技术及气质联用等先进技术和设备分析白酒风味组成已然成为科研热点，四甲基吡嗪的定性、定量检测建立在气相色谱、气相色谱质谱联用仪的基础上，结合不同的样品前处理方式进行测定6-10。随着检测技术及设备的迭代，白酒中四甲基吡嗪检测和预处理先进技术逐渐被建立，见表1。1.3四甲基吡嗪生物合成江南大学通过对四甲基吡嗪发酵过程进行跟踪，揭示了其在微生物体内的代谢机理，证实了乙偶姻和氨是微生物发酵产TTMP的前体物质。同时，对乙偶姻的生物合成途径进行解析：糖酵解产生丙酮酸，两分子丙酮酸缩合形成一分子a-乙酰乳酸，在a-乙酰乳酸脱羧酶的作用下a-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，2,3-丁二醇、2,3-丁二酮等物质与乙偶姻进行互相转化合成3。2酒曲中四甲基吡嗪2.1酒曲的重要性中国白酒与白兰地、伏特加、朗姆酒、金酒、威士忌并称世界六大蒸馏酒，白酒与世界多数蒸馏酒采用的液态发酵方式不同，中国白酒传承古法酿造技艺，采用固态发酵方式，其酿造核心为“酒曲”。“曲乃酒之魂”，中国白酒中的香味及多种风味，多来自于酒曲。酒曲，是以大米、小麦、大麦、豌豆等为原料，在一定温度、湿度环境下，经培养富集多种微生物而成19，在酿酒过程中促进酒糟正常发酵，为发酵过程提供必要的酶系、功能菌系和风味前体图1四甲基吡嗪化学结构式表1白酒中四甲基吡嗪检测方法研究进展序号12345678作者史改玲5彭奎11孙棣12，13黄杰14许佩勤15司冠儒16张温清17王国明18检测方法液液萃取(LLE)和气相色谱-质谱/选择离子扫描技术气相色谱法（固态酿造基质前处理方法）：浸提pH5，乙酸乙酯作为萃取剂，萃取15 min液相色谱串联质谱检测方法：通过气质全扫描的方式，采用面积归一化法初步定量，再进行色谱质谱测定气相色谱-三重四级杆质谱（GC-QQQ）MRM监测模式气相色谱仪和气相色谱质谱联用仪技术高效液相色谱技术：以甲醇与水为流动相，按体积比35 65配比，在phenomenex Gemini C18柱278 nm波长下检测气相色谱内标法液-液萃取（LLE）法结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术结果检测出20种白酒中D-柠檬烯、4-乙基愈创木酚、四甲基吡嗪等多种风味物质含量测定四甲基吡嗪的精密度分别为2.71%和9.59%，加标回收率分别在84.64%93.11%和83.33%101.04%。酱香白酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪含量较高相对标准偏差为5.70%，回收率在100%以上对8个白酒（非酱香型白酒）样品进行分析，均都能检出吡嗪类或呋喃类物质含量回收率94.67%100.33%，相对标准偏差3.29%1.77%回收率93.33%98.44%，相对标准偏差1.43%5.42%浓香型山庄老酒中四甲基吡嗪的含量在100 g/L以上优点检测快速、准确性高、专一性强操作简便，重现性较好，准确性较高，实现了样品的批量前处理灵敏度高，专属性好，可直接进样，适用大量样本测定快速、准确、选择性好、灵敏度高等优点很好的保留白酒中的吡嗪、呋喃类化合物的目标峰，适合白酒中风味物质的测定操作简便，具有较好的准确性和重复性操作简便，精密度好，准确度高的特点106106物质，其质量直接影响白酒的风味和品质。根据类型可将酒曲分为大曲、小曲、麸曲，不同香型白酒所用的酒曲原料和制作工艺不同，故其四甲基吡嗪等风味物质的含量不同。2.2不同香型酒曲四甲基吡嗪研究2.2.1酱香型酱香型大曲以小麦为原料制成，属高温大曲。酱香型高温大曲在生产过程中，因仓内温度、曲坯水分的差异，导致大曲外观呈现不同颜色，根据外观特征一般分为白曲、黄曲和黑曲3种，对3种颜色的曲块进行微生物结构及代谢产物分析，发现白曲中高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌最多20。随着“酱酒热”的兴起，酱香型高温大曲的风味机理研究近年来备受研究学者关注，从不同厂家所生产的酱香型高温大曲中分离出高产四甲基吡嗪菌株，筛选分离及四甲基吡嗪产量见表2。不同酒企因生产工艺、环境微生物圈不同，最终生产的高温大曲中四甲基吡嗪的含量不同。通过对高温大曲中高产四甲基吡嗪的微生物进行筛选、分离和产四甲基吡嗪测定，为酱香风味形成机制解析和强化大曲的应用提供了借鉴作用。2.2.2浓香型浓香型大曲主要以小麦为原料，有的配料大麦、豌豆等谷物，在一定的温度、湿度环境下，在曲坯上自然接种环境中的各种微生物制成，属于中温和中偏高温大曲。浓香大曲作为浓香型白酒生产的糖化剂、发酵剂和生香剂，通过三系（酶系、物系、菌系）作用于糟醅发酵，最终形成白酒中的复合香味。浓香大曲中富含丰富的微生物群系，不同地区、不同厂家生产出的浓香白酒，因微生物种类、数量不同，造成了不同品牌浓香型白酒香味风格的差异。钟桂芳等25从舍得大曲中分离出10株产四甲基吡嗪的菌株，通过筛选、分离确定2株高产四甲基吡嗪菌株A7和A18，经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）和蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus），其四甲基吡嗪的含量分别为350.98 mg/L、163.49 mg/L；郭春生等26从内蒙古某酒厂的浓香高温大曲中分离筛选出一株高产四甲基吡嗪菌株1-13，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），测定其四甲基吡嗪产量为112.26 mg/L。上述两种浓香大曲分离出的高产四甲基吡嗪菌株表明，不同厂家浓香大曲中的功能菌系不同，可能是造成南北地区浓香白酒在风味物质上的差异性所在。2.2.3其他香型在“酱酒热”和浓香大市场的背景下，关于两者大曲中高产四甲基吡嗪功能菌的研究逐渐增多，但是针对其他香型的研究较少，尤其是兼香型、米香型、豉香型等香型还鲜有报道，仅在清香型、特香型、芝麻香型等香型白酒中有少量研究。马美荣等27从红星二锅头大曲（清香型）中分离到11株芽孢杆菌，经筛选得到4株高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌，四甲基吡嗪产量为 12.521.39 mg/L；游勇等28从四特酒大曲（特香型）中分离筛选出1株地衣芽孢杆菌（ZRF-1），四甲基吡嗪相对含量3.45%；张温清等29从宣酒（芝麻香型）中筛选到1株高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌（XJB-104），四甲基吡嗪产量达202.54 mg/kg。3中国白酒中四甲基吡嗪3.1酿酒过程四甲基吡嗪研究现阶段对于中国白酒中四甲基吡嗪的研究，各香型白酒酿酒过程中四甲基吡嗪功能菌的研究较表2酱香大曲高产四甲基吡嗪菌种分离研究进展序号1234文献陈梦圆21张颖22梁慧珍23张春林24样品来源某酒厂国台国台贵酒分离菌株M12：Bacillus licheniformis(地衣芽孢杆菌)；L1：Bacillus siamensis(暹罗芽孢杆菌)GTBL-168：Bacillus licheniformis(地衣芽孢杆菌)X1：Bacillus sonorensis(索诺拉沙漠芽孢杆菌)YHB0165、YHB0169和YHB0171：枯草芽孢杆菌；YHB0170：巨大芽孢杆菌四甲基吡嗪产量M12：150.92 mg/LL1：40.75 mg/L12.22 mg/L23280.0 g/kgYHB0165：67.30；YHB0169：17.80；YHB0170：78.30；YHB0171：69.86 ng/g刘帮，王西，张亚东，甘浪飞，曾梦圆 中国白酒中四甲基吡嗪的研究进展107107酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)少，多为在酒曲中分离、筛选的研究。经文献检索，戴奕杰等30在酱香白酒第七轮次糟醅中进行功能菌筛选分离研究，得到1株产香功能较优的菌种，命名为DAI bj-1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacil-lus amyloliquefaciens），该菌种的发现，使淀粉芽孢杆菌与白酒风味物质间的联系得以建立。酱香型白酒采用“12987”的传统酿造工艺，有着“四高两长”的工艺特点，“高温堆积”是酱香白酒区别于其他香型白酒的特点之一，此过程网罗大量空气中的微生物于糟醅上，如酵母菌、芽孢杆菌等，这些微生物（主要是酵母菌）在大量繁殖后消亡、自溶，为糟醅增加了动物性蛋白源，提供了氨基础。糖与氨基酸在高温酿造过程中发生美拉德反应生成四甲基吡嗪，同时在芽孢杆菌、乳酸菌等微生物作用下，乙偶姻逐渐转化生成四甲基吡嗪，并大量累积在酱香型白酒酒体中5，也许这是在酱香型白酒酿酒环节中研究四甲基吡嗪功能菌的意义所在。3.2四甲基吡嗪菌株强化及在白酒中应用白酒生产过程中，大量酿酒微生物参与其中，主要为细菌、霉菌和酵母菌，参与糖化、发酵和生香过程。芽孢杆菌作为细菌的一科，在四甲基吡嗪的生物合成中具有重要作用。提高四甲基吡嗪的含量主要通过分离出高产菌株应用于生产，或对特定菌株进行强化。周榆林31在65 的温度下对目标菌株加热5 h，发现四甲基吡嗪含量提升了0.13 mg/100 mL；在发酵过程中，卢君32通过菌种强化和工艺优化的措施，将基酒中四甲基吡嗪的含量提高160.71%；陈诗佳33以酿酒酵母AY为出发菌株，通过基因改变优化培养，应用于清香型麸曲白酒的生产中，酒醅中乙偶姻含量提高320.38%，四甲基吡嗪含量提高74.66%。除单菌种强化外，还可通过多菌种共同作用提高白酒中四甲基吡嗪含量。韩兴林34将两株基础细菌和酵母菌进行混合培养，酒醅中四甲基吡嗪含量提高4%；吴钱弟35发现先接种酵母菌和根霉曲，再接种芽孢杆菌，四甲基吡嗪含量较纯种芽孢杆菌发酵组提高591.5 g/g，该试验的成功为多菌株发酵提高四甲基吡嗪含量奠定了基础。提高白酒中四甲基吡嗪含量，除了菌种的强化外，也有研究36-38在酿酒生产中直接添加最佳比例的产四甲基吡嗪功能菌菌株或者强化曲于酒醅中，实现白酒中四甲基吡嗪含量的提高。4展望随着白酒中健康因子研究方向的不断前进，四甲基吡嗪在白酒中的检测、代谢机理和合成受到了越来越广泛的关注，利用芽孢杆菌及其与其它菌株混合制作菌种强化液用于白酒生产，以提高白酒中四甲基吡嗪含量是白酒行业中广泛开展和应用的生物合成方法。随着“健康中国2030”规划纲要的实施，营养、美味和健康成为社会广泛关注的话题。中国白酒作为中国人餐桌上常见的消费品，对人体健康的影响受到社会各界的关注。四甲基吡嗪作为具有改善微血循环，抑制幽门螺杆菌代谢物诱发的炎症等作用的健康因子，其“量效关系”，即四甲基吡嗪在白酒中含量很低，摄入量难达到发挥功效的剂量的问题还亟待解决。市场上不同区域39、不同品牌白酒中四甲基吡嗪含量仍存在较大差异，如何进一步提高中国白酒中四甲基吡嗪含量和全面解析各香型白酒生产过程中四甲基吡嗪的生成是发酵行业需要解决的问题。参考文献：1谢国权,梁昕彤,张文先,等.四甲基吡嗪衍生物的合成及抗肿瘤活性研究J.化学研究与应用,2019,31(2)：308-313.2罗强,刘杰,刘志刚.酱香型白酒中生物活性物质抗幽门螺杆菌代谢物诱导的人胃上皮细胞炎症作用研究J.食品与发酵科技,2020,56(4)：11-17.3徐岩,吴群,范文来,等.中国白酒中四甲基吡嗪的微生物产生途径的发现与证实J.酿酒科技,2011(7)：37-40.4吴建峰.中国白酒中健康功能性成分四甲基吡嗪的研究J.酿酒科技,2007(1)：117-120.5史改玲,郭莹,李景辉,等.LLE-GC-MS-SIM检测白酒中9种微量功能成分J.食品科学,2021,42(20)：114-119.6乔慧,高晓娟.GC-NPD快速测定吡嗪类物质方法研究J.酿酒,2011,38(6)：45-46.7梅明明,朱婧,李妍,等.气相色谱-质谱法测定白酒中3种吡嗪类化合物J.现代预防医学,2015,42(14)：1081082597-2599.8张艳红,范文来,徐岩,等.顶空固相微萃取与气相色谱-火焰热离子检测器联用测定白酒中吡嗪类化合物J.分析试验室,2008(6)：39-41.9范文来,张艳红,徐岩.应用HS-SPME和GC-MS分析白酒大曲中微量挥发性成分J.酿酒科技,2007(12)：74-78.10刘坤.气相色谱法测定白酒中的主要成分J.河北化工,2012,35(3)：58-60.11彭奎,沈毅,郭杰,等.气相色谱测定固态酿造基质中四甲基吡嗪的前处理方法优化J.食品与发酵科技,2021,57(4)：127-130.12孙棣,赵贵斌,杨波.酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测及特点J.中国酿造,2015,34(12)：162-166.13孙棣,冯永渝,赵贵斌,等.液相色谱-质谱联用法快速测定酱香型白酒中的吡嗪类化合物J.食品科技,2015,40(7)：343-346.14黄杰,陆玮,汤有宏,等.基于GC-QQQ分析技术测定白酒中四甲基吡嗪的研究J.食品与发酵科技,2015,51(6)：50-52.15许佩勤,方毅斐,庄俊钰,等.白酒中吡嗪、呋喃类化合物的分析方法研究J.食品与发酵科技,2017,53(2)：85-93.16司冠儒,张温清,张显,等.HPLC快速检测芝麻香型白酒中四甲基吡嗪J.酿酒,2014,41(5)：89-91.17张温清,王永军,饶志明,等.宣酒芝麻香型白酒中吡嗪类健康功能因子的分析研究J.酿酒科技,2014(8)：37-39.18王国明,尹婉嫱,乔阳,等.浓香型“山庄老酒”中吡嗪类物质的分析研究J.中国酿造,2015,34(4)：146-149.19中国轻工业联合会.白酒工业术语：GB/T 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中国白酒中四甲基吡嗪的研究进展109109