乙型脑炎病毒NS1蛋白激活...通路诱导神经元细胞炎性焦亡_赵晓燕.pdf

第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023乙型脑炎病毒 NS1 蛋白激活 NFB 通路诱导神经元细胞炎性焦亡赵晓燕*，杨文静，高瑞娜，张勇刚（朔州职业技术学院，朔州 036002）摘要：乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黄病毒科，单股正链 RNA 病毒，JEV 感染主要引起中枢神经系统炎性损伤。细胞焦亡（pyroptosis）是一种依赖于胱天蛋白酶的炎性细胞程序性死亡。非结构蛋白 1（NS1）是黄病毒科类病毒与宿主相互作用的重要蛋白，在病毒的复制、致病及免疫逃逸过程中起关键作用。为了阐明 NS1蛋白是否影响 JEV 诱导的神经元细胞炎性焦亡及其作用机制，本研究以神经元细胞 SHSY5Y 为研究对象，以转染pcDNA3.1空载质粒为对照组、转染 pcDNA3.1NS1为实验组进行实验。结果表明，与转染 pcDNA3.1空载质粒组相比，转染 pcDNA3.1NS1组中 JEV 的病毒载量、焦亡相关因子 NLRP3、Caspase1、IL1及 IL18基因的表达量显著上升，并且与转染 pcDNA3.1空载质粒组相比，转染 pcDNA3.1NS1处理组中 pP65/P65蛋白的表达量显著上调，pIB/IB蛋白的表达量显著下调，表明 NS1蛋白能激活细胞中 NFB 信号通路。随后使用 NFB 激动剂 LPS及 NFB 抑制剂 BAY 117082 探究 NFB 通路对 NS1 蛋白诱导神经细胞 SHSY5Y 焦亡的影响。结果表明，与JEV+pcDNA3.1NS1处理组相比，JEV+pcDNA3.1NS1+BAY 117082处理组中焦亡相关因子基因表达量显著下降；JEV+pcDNA3.1NS1+LPS 处理组中细胞内焦亡相关基因的表达量显著上升。结论是 JEV 的 NS1蛋白可以通过激活细胞中 NFB通路诱导神经元细胞 SHSY5Y 发生炎性焦亡。本研究对 JEV 的感染机制做了进一步的补充，并表明 JEV中的 NS1蛋白具有开发亚单位疫苗的潜能。关键词：乙型脑炎病毒；NS1蛋白；神经元细胞 SHSY5Y；焦亡；NFB通路中图分类号：R373.3 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02043609DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004293乙 型 脑 炎 病 毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黄病毒科，单股正链 RNA 病毒，由多种蚊虫携带和传播。流行性乙型脑炎是由 JEV 感染引起的中枢神经系统炎性损伤的疾病，发生 JEV 感染后，JEV 能够突破血脑屏障进入中枢神经系统从而引起神经元发生炎性损伤，进而引发乙型脑炎等临床症状1。焦亡是一种伴随炎症发生的新型促炎程序性坏死，主要由炎性小体激活下游的 Gasdermin D（GSDMD）裂解介导，以 Caspase1的激活为特征，可以将细胞膜穿孔，从而诱发 IL1和 IL18等促炎性因子的释放，进而导致细胞溶解的炎性死亡2。研究表明，多种黄病毒科病毒的致病机制与细胞的炎性焦亡有关3，如 He Z 等报道神经祖细胞的炎性焦亡会加剧寨卡病毒诱导的脑萎缩4，提示细胞焦亡可能是寨卡病毒治疗的一种潜在靶点。但是 JEV感染与细胞炎性焦亡之间的关系仍然不清楚。JEV 的非结构（nonstructural，NS）蛋白是病毒与宿主相互作用的重要蛋白，在病毒复制、致病及免疫逃逸中起关键作用5。NS1蛋白是黄病毒科病毒中高度保守的一种非结构分泌型糖蛋白，在 JEV 病毒的复制、免疫保护、神经侵染性和致病性方面都起重要作用。NS1蛋白可以寄在细胞内形成同源二聚体，与细胞内膜系统的脂类结合，参与病毒复制。研究表明，NS1 蛋白在病毒诱导的炎症反应过程中具有两面性，Modhiran N 等人报道了利用 NS1蛋白构建保护性抗体来阻断黄病毒感染7；Coelho DR等人报道登革病毒 NS1 蛋白具有促炎作用并调节病毒免疫逃避8。而 NS1蛋白 JEV 诱导焦亡中的作用仍不清楚。本研究以神经细胞株 SHSY5Y 为研究对象，探究 NS1蛋白在 JEV 诱导神经元细胞炎性焦亡中的作用及其作用机制。材料与方法1 细胞与 JEV毒株人骨髓神经母细胞瘤细胞株 SHSY5Y 购自中科院上海细胞资源中心。JEV 减毒活疫苗株 SA14142 保种于实验室。使用乳仓鼠肾细胞（BHK21）（保种于实验室）扩充 JEV 病毒，简而言之，将 BHK收稿日期：20220707；接受日期：20220923作者简介：赵晓燕（1985），女，从事生物化学与分子生物学研究，Email：*通讯作者：赵晓燕（1985），女，从事生物化学与分子生物学研究，Email：开放科学（OSID）2期赵晓燕，等.乙型脑炎病毒 NS1蛋白激活 NFB通路诱导神经元细胞炎性焦亡21细胞接种于 T75瓶中，待细胞生长至 80%汇合度时，接种 JEV 弱毒株 600 L，当细胞出现 50%病变时，将细胞培养瓶置于20冰箱中反复冻融 5 次，收集病毒，于80保存。2 试剂与仪器胎牛血清、胰酶、DMEM 培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国 Thermo Fisher公司；二甲基亚砜（DMSO 溶液，纯度98%）、乙醇（纯度99%）、三氯甲烷和异丙醇购买于上海阿拉丁试剂有限公司；Trizol 购买于日本 takala 公司。pcDNA3.1NS1 质粒 依 据 引 物 序 列JEV NS1 F 5CGGGATCCGACACTGGATGTGCCATTGACAT3，JEVNS1R5 CCCTCGAGTCAGTGTAAGTGATGCCCCCAAGCAT39由北京擎科生物公司构建，并随后连接到 pcDNA3.1 空载质粒上，质粒在感受态细菌中进行转化质粒储存液浓度为 1.0mg/mL。lipo8000转 染 试 剂 购 自 江 苏 碧 云 天 生 物 科 技 有 限 公 司。RIPA 裂解液、BCA 法蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司。NS1一抗及 JE1一抗购自美国 Abcam 公司。P65一抗、pP65一抗、IB一抗、pIB一抗及actin 一抗购自江苏碧云天生物科技有限公司。FL600型酶标仪购自美国 BioTek 公司；TDZ4WS低速台式离心机购自长沙湘仪有限公司；CKX53倒置相差显微镜购自日本奥林巴斯株式会社。恒温恒湿细胞培养箱购自美国赛默飞公司。3 神经母瘤细胞 SHSY5Y培养神经母瘤细胞株 SHSY5Y 购自中国科学院上海细胞资源中心。培养于 37、5%CO2培养箱，孵育于 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及 100 U/mL链霉素的 DMEM 培养基中。4 JEV拷贝数的检测JEV 拷贝数的检测方法按参考文献所述10，简而言之，使用 TRizol法提取神经细胞 SH SY5Y 中的总 RNA，使用反转录试剂盒将总 RNA 反转录成第 一 互 补 链 cDNA，依 据 引 物 序 列 F 5GCCACCCAGGAGGTCCTT 3；R 5 CCCCAAAACCGCAGGAAT 3 对 cDNA 中 JEV的标志基因及内参基因进行扩增，并根据扩增曲线计算 JEV的 RNA拷贝数。5 JEV病毒滴度测定将 1104个 SHSY5Y 细胞接种于 96 孔板，用MOI=0.1 的 JEV 病毒感染 BHK21 细胞 12h、24h、36h 及 48 h，每个时段于显微镜下观察细胞病变，并记录病变孔数，计算 TCID50。6 荧光定量 PCR 实验检测 SHSY5Y 细胞中焦亡因子表达SHSY5Y 细胞内的总 RNA 使用 RNAiso Plus试剂盒按照说明书提取。用 1 000 ng 总 RNA 进行反 转 录，得 到 cDNA。使 用 ABI Prism Step One Plus 检测系统进行实时聚合酶链式反应 PCR 测定SHSY5Y 细胞中 NLRP3、Caspase1、白细胞介素1（IL1）及白细胞介素18（IL18）基因的表达量。引物由北京擎科生物公司合成（表 1）。7 Western Blot 检测神经细胞 SHSY5Y中蛋白的表达将 2105个细胞接种在 6 孔板中，提取细胞总蛋白后用 BCA 法测定蛋白浓度。取 40ng蛋白样品进 行 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳，然 后 将 蛋 白 电 转 到PVDF 膜上，转膜结束后，加入 1%封闭液封闭 1 h，随后加入一抗（NS1、JE1、P65、pP65、IB、pIB及 actin，稀释比例为 1：1 000）4过夜孵育，用TBST 清洗 PVDF 膜 3 次，加 入 山 羊 抗 兔 二 抗（1：5 000），室温孵育 1h。将 PVDF 膜浸泡在显影液中孵育 1min，使用化学发光凝胶成像仪扫描成像。8 统计学分析实验数据均以均值均值标准差（X-S）形式表示，数据用统计软件 GraphPad Prism 8.0 进行分表 1基因引物序列Table 1Sequences of gene primersTarget genesactinNLRP3Caspase1IL1IL18Forward（5 3）CACGATGTACCCTGGGATCGCTGGCATCTGGGGAAACCTGAAAAGCCATGGCCGACAAGTTCGAGGCACAAGGCACAAATCGCTTCCTCTCGCAACAAReverse（5 3）GCCGATCCACACCGAGTATTTCTGTGTCACAAGGCTCACCACAGAGCCCATTGTGGGATGTGGCTGCTTCAGACACTTGAGGTCCGGGGTGCATTATCTCT 437病 毒 学 报39卷析。多组间比较采用单因素方差分析，组间显著性差 异 表 示 如 下：*P0.05，*P0.01，#P0.05，#P0.01，每组实验重复最少三次。结果1 神经细胞 SHSY5Y中 NS1蛋白表达测定为 探 究 pcDNA3.1 NS1 质 粒 对 神 经 细 胞SHSY5Y 中 NS1 表达的影响。在 SHSY5Y 细胞中，使用 MOI=0.1 的 JEV 的病毒量感染神经细胞SHSY5Y 36 h，随 后 使 用 EL 转 染 试 剂 转 染pcDNA3.1 空载质粒及 pcDNA3.1NS1 质粒 48 小时，收取细胞中的总蛋白。结果如图 1所示，与转染pcDNA3.1 空载质粒组比较，转染 pcDNA3.1NS1质粒组中 NS1 蛋白的表达量显著上升。以上结果表明，转染 pcDNA3.1NS1 质粒能上调神经细胞SHSY5Y中 NS1蛋白的表达。2 乙型脑炎病毒入侵动力试验使用 MOI=0.1 的 JEV 感染 SHSY5Y 细胞，分别在 12 h、24 h、36 h 及 48 h 测定 JEV 的病毒滴度。结 果 如 图 2A 所 示，随 着 JEV 的 感 染 时 间 增 加，SHSY5Y 细胞 中 的 病 毒 滴 度 逐 渐 增 加。并 且，JEV 在 SHSY5Y 细 胞 中 的 病 毒 滴 度 在 36 及48 h 无 显 著 增 加，表 明 病 毒 在 36 h 时 已 达 到 最大 载 毒 量。选 择 36 h 病 毒 感 染 用 于 后 续 实 验。日 本 脑 炎 乙 脑 黄 病 毒 主 要 由 三 个 结 构 蛋 白 组成：核 衣 壳 蛋 白 C、包 膜 糖 蛋 白 M 和 E。日 本 脑炎 病 毒 E 糖 蛋 白（JE1）是 由 病 毒 基 因 组 编 码 的三 个 结 构 蛋 白 之 一，JE1 被 认 为 与 病 毒 粘 附 和进 入 宿 主 细 胞 和 诱 导 保 护 性 免 疫 反 应 有 关。JE1 蛋 白 的 表 达 反 映 了 细 胞 内 JEV 的 感 染 量。结 果 如 图 2B 所 示，细 胞 中 JE1 蛋 白 的 表 达 量 随JEV 感 染 时 间 逐 渐 增 加，并 在 36 h 达 到 峰 值。以 上 结 果 表 明，JEV 对 SHSY5Y 细 胞 的 入 侵 随时间延长增加，且在 36 h 达到最大载毒量。3 乙型脑炎病毒 NS1蛋白对病毒增殖的影响在 SHSY5Y 细胞中，使用 EL 转染试剂转染图 1pcDNA3.1NS1质粒对神经细胞 SHSY5Y中 NS1表达影响注：pcDNA3.1-NS1质粒对神经细胞 SHSY5Y中 NS1表达影响。A.NA1蛋白表达（n=3）；B.NS1蛋白表达量比较（n=3）。与 pcDNA3.1处理组相比，*P0.01Figure 1Effect of PCDNA3.1NS1 plasmid on NS1 expression in SHSY5Y cellsNotes：A.Expression of NS1 protein（n=3），B.The comparison of NS1 expression level（n=3）.Compared with the pcDNA3.1 treatment group，*P0.01图 2JEV病毒载量注：A.JEV病毒滴度（n=5）；B.JE1蛋白表达量（n=3）；与 12h JEV感染组相比，*P0.01Figure 2JEV loadNotes：A.JEV titer（n=5）；B.JE1 protein expression（n=3）；compared with the 12h JEVinfection group，*P0.01 4382期赵晓燕，等.乙型脑炎病毒 NS1蛋白激活 NFB通路诱导神经元细胞炎性焦亡pcDNA3.1空载质粒及 pcDNA3.1NS1质粒 48 h，通过测定病毒滴度及收取细胞中总蛋白测定 JE1蛋白的表达量，来探究 NS1蛋白对病毒增殖的影响。结果如图 3 所示，与空白对照组（Blank 组）相比较，JEV 感染组与 JEV+pcDNA3.1 处理组中病毒滴度及 JE1 蛋白表达量显著上升（P 0.01）。与 JEV 感染组 相 比 较，pcDNA3.1NS1 处 理 组 中 病 毒 滴 度及 JE1 蛋 白 表 达 量 显 著 上 升（P 0.01）。以 上结 果 表 明，乙 型 脑 炎 病 毒 NS1 蛋 白 可 以 促 进JEV 病毒的增殖。4 乙型脑炎病毒 NS1 蛋白对神经细胞 SHSY5Y焦亡的影响为 探 究 乙 型 脑 炎 病 毒 NS1 蛋 白 对 神 经 细 胞SHSY5Y 焦亡的影响，使用 MOI=0.1 的 JEV 的病毒 量 感 染 神 经 细 胞 SHSY5Y 36 h，并 转 染pcDNA3.1NS1 质粒，提取 SHSY5Y 细胞中的总RNA，通过荧光定量 PCR试验探究了乙型脑炎病毒NS1 蛋白对神经细胞 SHSY5Y 中焦亡相关基因NLRP3、Caspase1、IL1 及 IL18 表达量的影响。结果如图 4 所示，与转染 pcDNA3.1 空载质粒组相比，转 染 pcDNA3.1+NS1 质 粒 组 显 著 上 调 了SHSY5Y 细 胞 内 焦 亡 相 关 基 因 的 表 达 量（P 0.05）。以上结果表明，乙型脑炎病毒 NS1蛋白能诱导神经细胞 SHSY5Y焦亡。5 乙型脑炎病毒 NS1 蛋白对神经细胞 SHSY5Y中 NFB通路影响为 探 究 乙 型 脑 炎 病 毒 NS1 蛋 白 对 神 经 细 胞SHSY5Y 中 NFB 通路影响。使用 MOI=0.1 的JEV 的病毒量感染神经细胞 SHSY5Y 36 h，并转染pcDNA3.1NS1质粒，提取 SHSY5Y 细胞中的总蛋白，通过 western blot试验探究了乙型脑炎病毒 NS1蛋白对神经细胞 SHSY5Y 中 NFB 通路影响。结果如图 5所示，转染 NS1质粒显著上调了 SHSY5Y细胞内 NFB 通路中 P65 蛋白的表达量，下调 IB蛋白的表达量（P 0.05）。以上结果表明乙型脑炎病 毒 NS1 蛋 白 能 激 活 SHSY5Y 细 胞 内 NF B通路。6 NF B 通 路 对 NS1 蛋 白 诱 导 神 经 细 胞SHSY5Y焦亡的影响使 用 NFB 通 路 的 特 异 性 抑 制 剂 BAY 117082 和激活剂 LPS 探究 NFB 通路对 NS1 蛋白诱导神经细胞 SHSY5Y 焦亡的影响。使用 MOI=0.1 的 JEV 的病毒量感染神经细胞 SHSY5Y 36 h，并转染 pcDNA3.1NS1 质粒，随后分别用 NFB 通路的特异性抑制剂 BAY 117082 和激活剂 LPS 预处理 SHSY5Y 细胞 2 h，提取 SHSY5Y 细胞中的总 RNA，通过荧光定量 PCR 试验探究了 NFB 通路在 NS1蛋白诱导神经细胞 SHSY5Y 焦亡中的具图 3乙型脑炎病毒 NS1蛋白对病毒增殖影响注：A.病毒滴度（n=5）；B.JE1蛋白表达量（n=3）；与空白对照组（Blank组）相比，*P0.01，与 JEV组相比，#P0.01Figure 3Effect of JEV NS1 protein on virus proliferationNotes：A.Virus titer（n=5）；B.Expression of JE1 protein（n=3）；compared with the Blank group，*P0.01；compared with the JEV group，#P0.01 439病 毒 学 报39卷体作用。结果如图 6 所示，与 Mock 组相比较，转染NS1 质粒显著上调了 SHSY5Y 细胞内焦亡相关基因的表达量（P 0.05）。而在使用 NFB 通路的特异性抑制剂 BAY 117082预处理后，SHSY5Y细胞内焦亡相关基因的表达量显著下降（P 0.05）；在使用 NFB 通路的激活剂 LPS 预处理后，SHSY5Y 细 胞 内 焦 亡 相 关 基 因 的 表 达 量 显 著 上 升（P 0.05）。以上结果表明乙型脑炎病毒 NS1 蛋白可能是通过激活 SHSY5Y 细胞内 NFB 通路来诱导神经细胞 SHSY5Y焦亡。讨论乙 型 脑 炎 病 毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黄病毒科，单股正链 RNA 病毒，由多种蚊虫携带和传播，JEV 感染主要引起中枢神经系统产生炎性损伤。NS1蛋白是 JEV 的一种非结构性蛋白，在病毒复制、致病及免疫逃逸中起关键作用11。焦亡是一种伴随炎症发生的新型促炎程序性坏死，以Caspase1 的激活为特征，可以将细胞膜穿孔，从而诱发 IL1和 IL18等促炎性因子的释放，进而导致细胞炎性死亡12。本研究以神经细胞株 SHSY5Y为研究对象，探究 NS1蛋白在 JEV 诱导神经元细胞炎性焦亡中的作用及其作用机制。国内外多项有关黄病毒科属病毒感染机制的基础研究表明，黄病毒科属病毒感染与细胞焦亡相关，包括寨卡病毒和登革热病毒等4，13。Wang Z Y 等人的研究表明，神经细胞发生炎性焦亡会加剧寨卡图 4NS1蛋白对神经细胞 SHSY5Y焦亡的影响注：A.NLRP3基因表达量（n=5）；B.Caspase1基因表达量（n=5）；C.IL1基因表达量（n=5）；D.IL18基因表达量（n=5）；与空白对照组（Blank组）相比，*.P0.05，*.P0.01，JEV+pcDNA3.1NS1与 JEV+pcDNA3.1相比，#.P0.01；JEV+pcDNA3.1与 pcDNA3.1相比，$.P0.05，$.P0.01Figure 4Effect of NS1 protein on the pyroptosis of SHSY5Y cellsNotes：A.Expression of NLRP3 gene（n=5）；B.Expression of caspase1 gene（n=5）；C.Expression of IL1 gene（n=5）；D.Expression of IL18 gene（n=5）；compared with Blank group，*.P0.05，*.P0.01，JEV+pcDNA3.1NS1 compared with JEV+pcDNA3.1，#.P0.01；JEV+pcDNA3.1 compared with pcDNA3.1，$.P0.05，$.P0.01 4402期赵晓燕，等.乙型脑炎病毒 NS1蛋白激活 NFB通路诱导神经元细胞炎性焦亡病毒诱导的脑萎缩，提示焦亡为寨卡病毒治疗的靶点之一，并且 San Suwanmanee等人的研究表明登革热病毒可以通过诱导机体内神经元细胞炎性焦亡诱导机体产生炎性损伤。Wang Z Y 等人的研究也表明由细胞焦亡产生的 IL1 会促进 JEV 的神经侵袭，加剧 JEV 感染14。NS1 蛋白是黄病毒科属病毒的一种非结构性蛋白在病毒复制中起关键作用，TeSheng Lien 等人的研究表明注射 NS1 蛋白会引发小 鼠 Nlrp3 炎 症 小 体 依 赖 性 内 皮 功 能 障 碍 和 出血15，以上研究表明 NS1蛋白可能是 JEV 病毒感染入侵的关键蛋白。本研究通过对 SHSY5Y 细胞转染 NS1蛋白探究了 NS1蛋白对 JEV 诱导 SHSY5Y细胞焦亡的影响。NFB 通路最早由 David Baltimore 发现，包括IB 蛋白和 NFB（P65）二聚体，在机体的炎症反应、免疫应答等过程中发挥重要作用16。当细胞受到外界刺激后，IB 激酶会被激活，导致 IB 蛋白磷酸化降解，NFB 二聚体释放，从而使 NFB 信号通路被激活。国内外多项研究表明，在多种类型病毒感染诱导的炎性焦亡中，NFB 通路在其中都起重要作用，如 Qingyan Ye 等研究表明通过抑制NFB/NLRP3依赖性的细胞焦亡能对鼠诺如病毒感染的 RAW264.7 巨噬细胞起保护作用17。并且，国内外多项研究表明 NS1 蛋白发挥生物学功能也与 NFB 信号通路相关18，如 Breno M Silva等人的研究表明登革热病毒的非结构蛋白 1（NS1）加剧了HepG2 细胞中 NFB 信号的活性19，Jeong Yoon Lee J Y 等人的研究表明寨卡病毒编码的 NS2A 和NS4A 结构蛋白下调 NFB启动子的活性20。本研究中，与转染 pcDNA3.1 空载质粒组相比较，转染pcDNA3.1NS1 质粒组 NFB 信号活性显著上调，表明 NS1蛋白能加剧 JEV 诱导的 SHSY5Y 细胞中图 5NS1蛋白对神经细胞 SHSY5Y中 NFB通路影响注：A.P65、pP65、IB及 pIB蛋白表达量（n=3）；B.B.pP65/P65，pIB/IB的表达量比较（n=3）。与空白对照组（Blank组）相比，*P0.05，*P0.01Figure 5Effect of NS1 protein on the NFB pathway in SHSY5Y cellsNotes：A.Protein expression of P65，pP65，IB and pIB（n=3）；B.The comparison of pP65/P65，pIB/IB level（n=3）.Compared with the Blank group，*P0.05，*P0.01 441病 毒 学 报39卷NFB信号的表达。综上所述，非结构蛋白 NS1能加剧 JEV 诱导的SHSY5Y 神经元细胞炎性焦亡，这一促进作用与激活 NFB 通路有关。本研究对 JEV 的感染机制做了进一步的补充，并表明 JEV 的 NS1蛋白具有开发亚单位疫苗的潜能。参考文献：1 韩超逸，汤德元，曾智勇，黄涛，王彬，郭倩妤，廖少山，张森，杨志刚，晏仁潭.日本乙型脑炎病毒感染中枢神经系统研究进展 J.中国兽医学报，2021，41（04）：803807.M.2021.2 于雯龙，苑庆欣，于春龙，于洪博.细胞焦亡及其相关疾病研究进展 J.浙江畜牧兽医，2022，47（02）：1617+42.M.2022.3 张琛，宋正然，王培刚.细胞焦亡在黄病毒致病机制中的作用 J.微生物学报，2022，62（02）：476488.M.2022.4 He Z，An S，Chen J，Zhang S，Tan C，Yu J，Ye H，Wu Y，Yuan J，Wu J，Zhu X，Li M.Neural progenitor cell pyroptosis contributes to Zika virus induced brain atrophy and represents a therapeutic target J.Proc Natl Acad Sci U S A，2020，117（38）：2386923878.5 王海源.黄热病毒非结构蛋白 NS1 及其特异性抗体的结构基础研究 D.广西大学，2019.图 6NFB通路对 NS1蛋白诱导神经细胞 SHSY5Y焦亡的影响注：A.NLRP3基因表达量（n=5）；B.Caspase1基因表达量（n=5）；C.IL1基因表达量（n=5）；D.IL18基因表达量（n=5）；与 Mock组相比，*P0.05，*P0.01；与 pcDNA3.1组相比，*P0.05，*P0.01；与 JEV+pcDNA3.1NS1组相比，#.P0.05，#.P0.01Figure 6Effect of NFB signaling on the pyroptosis of SHSY5Y cells induced by NS1 protein Notes：A.Expression of NLRP3 gene（n=5）；（B.Expression of caspase1 gene（n=5）；（C.Expression of IL1 gene（n=5）；（D.Expression of IL18 gene（n=5）；compared with the Mock group，*P0.05，*P0.01；compared with the JEV+PCDNA3.1NS1 group，#P0.05，#P0.01 4422期赵晓燕，等.乙型脑炎病毒 NS1蛋白激活 NFB通路诱导神经元细胞炎性焦亡6 Li N，Zhang Z R，Zhang Y N，Liu J，Deng C L，Shi P Y，Yuan Z M，Ye H.Q，Zhang B.A replication defective Japanese encephalitis virus（JEV）vaccine candidate with NS1 deletion confers dual protection against JEV and West Nile virus in miceJ.NPJ Vaccines，2020，5（1）：73.7 Modhiran N，Song H，Liu L，Bletchly C，Brillault L，Amarilla A A，Xu X，Qi J，Chai Y，Cheung S T M，Traves R，Setoh Y X，Bibby S，Scott C A P，Freney M E，Newton N D，Khromykh A A，Chappell K J，Muller D A，Stacey K J，Landsberg M J，Shi Y，Gao G F，Young P R，Watterson D.A broadly protective antibody that targets the flavivirus NS1 proteinJ.Science，2021，371（6525）：190194.8 Coelho D R，Carneiro P.H，Mendes Monteiro L，Conde J N，Andrade I，Cao T，Allonso D，White Dibiasio M，Kuhn R J，Mohana Borges R.ApoA1 Neutralizes Proinflammatory Effects of Dengue Virus NS1 Protein and Modulates Viral Immune EvasionJ/OL.J Virol，2021，95（13）：e0197420.9 Zhou D，Pei 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with NS1 Protein Aggravates JEV induced Pyroptosis via Activation of the NFB Signaling Pathway in SHSY5Y CellsZHAO Xiaoyan*，YANG Wenjing，GAO Ruina，ZHANG Yonggang（Shuozhou Vocational Technology College，Shuozhou 036002 China）Abstract：The Japanese encephalitis virus（JEV）is a single stranded，positive stranded RNA virus of the family flaviviridae.JEV infection primarily causes inflammatory damage in the central nervous system.Pyroptosis is a type of programmed death of inflammatory cells mediated by cystatin proteases.Nonstructural protein 1（NS1）plays a key part in virushost interactions and in viral replication，pathogenesis and immune escape.We wished to elucidate if NS1 protein affected JEVinduced inflammatory pyroptosis in neuronal cells and investigate its mechanism.The present study was conducted with neuronal cells（SHSY5Y），which were transfected with pcDNA3.1 null plasmid（control group）or pcDNA3.1 NS1（experimental group）.We discovered that the viral load as well as expression of NLR family pyrin domain containing 3，caspase 1，interleukin（IL）1 and IL 18 genes was increased significantly in the pcDNA3.1 NS1 transfection group compared with that in the pcDNA3.1 tr