活性碳纤维表面硝酸-铁（Ⅲ）改性对乳酸菌固定化的影响.pdf

第4卷 第5期 2009 年 5 月 341 活性碳纤维表面硝酸-铁()改性 对乳酸菌固定化的影响 黄臣勇1，王 鹏1，徐 伟1,2，迟国达1（1.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨 150090；2.哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨 150076）摘 要：采用HCl、H2SO4、HNO3和FeCl3溶液分别对活性碳纤维进行表面改性，考查改性前后活性碳纤维表面酸性含氧官能团和表面元素含量变化，以及作为乳酸菌固定化载体的单丝菌膜生长情况。结果表明：经HNO3和H2SO4改性后，活性碳纤维表面酸性含氧官能团量随反应时间增加，5 h后增加速度缓慢，并负载有相应的N和S等元素;单丝吸附乳酸菌膜厚度随表面O和N元素含量增加而增大。经浓HNO3改性 5 h再经 0.1 mol/L FeCl3改性 4 h后，活性碳纤维表面负载的Fe()含量为 0.156 3 mol/kg，单丝乳酸菌膜厚度可达 40 m，经HNO3-Fe()改性后的活性碳纤维用于淀粉生产工业废水制备乳酸试验，使得发酵周期缩短约 8 h，乳酸产率提高 2.8%。关键词：食品工业；活性碳纤维；乳酸；改性；菌体固定化影 中图分类号：X792 文献标识码：A 文章编号：16737180(2009)0503417 Effect of activated carbon fiber modified by HNO3-Fe(III)on the immobilization of Lactobacillus Huang Chenyong1，Wang Peng1，Xu Wei1.2，Chi Guoda1(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.School of Foodstuff Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)Abstract:The effects of surface modification by HCl,H2SO4,HNO3,and FeCl3 on the characteristics of activated carbon fibers(ACFs),such as the contents of surface acid oxygenic functional groups,surface elements and the thickness of single-silk biofilm,were experimentally studied.Results showed that the amount of surface acid oxygenic functional groups increased with immersed time of ACFs in HNO3 and H2SO4,and almost reached the highest value after five hours.Corresponding elements such as nitrogen and sulfur were also added to the surface of modified ACFs.In addition,the thickness of single-silk biofilm of Lactobacillus increased with the raising content of oxygen and nitrogen on the surface.After modified by nitric acid for 5 h and by 0.1 mol/L FeCl3 for 4 h in turn,the surface of ACFs had a maximal Fe()content about 0.1563 mol/kg,and a thickness of single-silk biofilm of ACFs up to about 40 m.The ACFs modified by HNO3-Fe()were used in the experiment producing lactic acid 基金项目：国家自然科学基金(50778053)作者简介：黄臣勇，(1985)，男，硕士研究生 通信联系人：王鹏，教授， 中国科技论文在线 Sciencepaper Online 第4卷 第5期 2009 年 5 月 342 中国科技论文在线 Sciencepaper Online from the wastewater from starch industry,and could reduce the fermentation period by about 8 hours,and increase the yield of lactic acid by 2.8%.Key words:foodstuff industry；activated carbon fibers；lactic acid；modification；immobilization 0 引 言 乳酸是世界上三大有机酸之一，广泛应用于食品、医药和化工等诸多领域，随着新型环保材料聚乳酸(PLA)的开发应用，L-乳酸的生产再次受到关注1-2。利用固定化技术生产乳酸可以提高细胞浓度和乳酸产率。微生物细胞的固定化，以包埋法和吸附法最为常用3。包埋法制得的固定化微生物对传质有一定的影响。同时，固定化菌体发酵乳酸，目前通常用海藻酸钙包埋，但在厌氧条件下易被微生物分解，存在寿命短和强度低等缺点4。吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上，微生物细胞与载体之间不起化学反应，载体可循环使用5。但所用的无机类载体，大部分为粒状载体，如碳酸类石、玻璃材料、陶瓷颗粒、矿渣及活性碳等粒子6。尽管机械强度和生物相容性较好，但由于比重较大，不利于在流化床等流化态反应器中运行，且回收利用较困难。活性碳纤维(Active Carbon Fiber，ACF)具有比表面积大、吸附容量大、强度高、滤阻小、不易粉化和密实、耐强酸强碱以及可多次重复使用等优点7。其对流体阻力小，在低压下能运行，用于食品和医疗卫生工业还可以节约能源。ACF 作为生物膜载体，目前主要应用于废水处理方面8。用ACF 快速固着好氧菌，固着化速率较高，表面生物膜厚度也较厚9-10。ACF 进行表面化学改性后，其对水处理过程中的好氧菌的固着作用有着明显的改善作用11-12。本研究对 ACF 表面进行化学改性处理，增加乳酸菌与载体表面之间的亲和力，并对改性后的 ACF 进行XPS 射线衍射表征。由单丝菌膜厚判定 ACF 载体对乳酸细菌的吸附效果，得到 ACF 最佳表面改性方案。改性后的 ACF 作为固定化乳酸细菌的载体，在淀粉生产工业废水乳酸发酵中可反复使用，获得良好效果。1 材料与方法 1.1 材料与仪器设备 1.1.1 实验材料 干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp rhamnosus)W4-3-9 菌株（经实验组微波诱变选育出的L-乳酸高产菌株13）；沥青基活性碳纤维丝（购于鞍山赛诺达碳纤维有限公司，单丝直径4 m）；淀粉生产工业废水（取自黑龙江昊天玉米淀粉厂）、FeCl3、丙酮、氢氧化钠、浓盐酸、浓硝酸和浓硫酸。MRS 培养基(/(g/L)：葡萄糖 50，蛋白胨 l0，牛肉浸膏 l0，酵母膏 5，乙酸钠 5，柠檬酸二铵 2，K2HPO4 2.0，MgSO47H2O 0.58，MnSO44H2O 0.25，吐温80 1 mL,pH 6.5。1.1.2 实验设备和仪器 立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50S11)、电子天平（ALC-210.2 型）、单人单面净化工作台（SW-CJ-FD型）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9203A 型）、X-射线光电子能谱仪（PHI5700 型）、扫描电子显微镜(HITACHI S-3400N)、离子溅射仪(HITACHI E-1010)、冷冻干燥仪(HITACHI S-2030)、恒温培养箱和循环水式多用真空泵。1.2 实验方法 1.2.1 ACF 的预处理 将ACF 预先用丙酮浸泡3 h 后，经真空泵抽涤，除去表面的油溶性物质，再用去离子水冲洗并浸泡、煮沸，每隔0.5 h 换水1 次，共煮沸3 h，将ACF 放入120 烘箱烘2 h 后取出，置于干燥器内待用。1.2.2 ACF 表面化学改性 1)ACF 表面酸改性:分别称取 1 g 预处理后的ACF 放入若干小烧杯中，再分别用 20 mL 浓 HCl、浓H2SO4和浓 HNO3浸泡不同时间，用去离子水冲洗至中性后，将ACF 放入120 烘箱烘2 h。取出置于干燥器内待用。2)ACF 表面Fe()改性:分别称取1 g 经预处理后的ACF 放入若干小烧杯中，再用0.1 mol/L FeCl3溶液20 mL 分别浸泡不同时间。用去离子水冲洗至溶液黄色消失后，将ACF 放入120 烘箱烘2 h 后取出，置于干燥器内待用。1.2.3 改性ACF 表面特性表征 1)ACF 表面酸性含氧官能团的测定:采用酸碱滴定法测定ACF 改性前后表面酸性含氧官能团含量。2)ACF 表面元素的XPS 表征:采用X-射线光电子能谱仪(XPS)对改性前后 ACF 进行表征。通过 XPS 全谱图分析出ACF 表面C、N、O、S 和Fe 等元素含量，通过元素分峰图分析出 ACF 表面元素以何种结合态形式存在。3)ACF表面Fe元素含量的测定:采用络合滴定法对ACF 表面Fe 元素含量进行测定。用表面Fe 元素含量表第4卷 第5期 2009 年 5 月 343征表面电性。1.2.4 ACF 单丝菌膜厚度的测定 分别准确称量0.1 g 改性前后的ACF，放入若干支装有5 mL MRS 培养基的试管中一并灭菌，且分别接入0.5 mL 乳酸菌液，发酵36 h 后，用接种针从发酵液中挑取ACF，制备玻片，用显微目镜测微尺，在一定长度的单丝范围内，连续观察记录 10 个菌膜厚度，取其平均值为该ACF 的单丝菌膜厚度。2 结果与讨论 2.1 改性ACF 表面特性分析 2.1.1 酸改性ACF 表面酸性含氧官能团的变化 酸改性ACF 表面酸性含氧官能团含量（图1），对微生物吸附会产生较大的影响，研究表明14，适量的表面酸性含氧官能团，有助于增加ACF 的单丝菌膜厚度。图1 酸改性ACF表面酸性含氧官能团的变化 Fig.1 Changes in the content of surface acid oxygenic functional groups of ACF modified by acid 由图 1 可知，ACF 经 HCl 改性，其表面 b(酸性含氧官能团)随改性时间无明显变化；而ACF 经H2SO4及HNO3改性，其表面b(酸性含氧官能团)随着改性时间增加，较之未经改性的ACF 显著增加。2.1.2 FeCl3改性ACF 表面b(Fe()变化 当 ACF 表面含有大量的酸性含氧官能团时，材料表面呈现较强的负电性。而在发酵液环境下(pH3.5)乳酸细菌的表面由于氨基酸的电离而带有负电荷，这时乳酸细菌在 ACF 载体表面将产生同种电荷相斥作用，从而影响乳酸菌在ACF 表面的固定化。通过FeCl3溶液对ACF 进行改性，让ACF 表面带上Fe()，从而达到使其表面带上正电荷的目的。从图2 可以看出，经FeCl3改性4 h，其表面b(Fe()达到0.051 mol/kg，当改性时间再增加时，其b(Fe()达到饱和而不再变化。2.1.3 改性ACF 表面元素的XPS 表征 通过XPS 全谱图分析得出改性后表面C、N、O、S 和Fe 等元素的变化，结果如图3 和表1 所示。由表1可知，HCl 改性后的 ACF 表面元素变化不大；H2SO4（或FeCl3）改性的ACF 表面能带上相应的S（或Fe）元素，但其含量较低；HNO3改性的 ACF 与未经改性ACF 比较，其表面O 和N 元素含量有明显增加。图2 FeCl3改性ACF表面b(Fe()变化 Fig.2 Changes in the b(Fe()of ACF modified by FeCl3 图3 改性前后ACF表面XPS全谱图 Fig.3 XPS of ACF surface before and after modification 活性碳纤维表面硝酸-铁()改性对乳酸菌固定化的影响 第4卷 第5期 2009 年 5 月 344 中国科技论文在线 Sciencepaper Online 表1 改性前后ACF 表面各元素摩尔比(x)变化 Table 1 Changes of percentage of various elements on the surface of ACF before and after modification%No.C 1s O 1s N 1s S 2p Fe 2p Si 2p ACF 86.87 11.24 1.59 0.30 ACF 86.51 11.65 1.63 0.21 ACF 83.02 14.17 1.72 0.86 0.23 ACF 81.34 15.25 3.23 0.18 ACF 84.53 12.40 1.83 1.12 0.12 注：ACF未经改性的 ACF；ACFHCl 改性的 ACF；ACFH2SO4改性的 ACF；ACFHNO3改性的 ACF；ACFFeCl3改性的 ACF；“”为未检出。通过元素分峰图，进一步分析 ACF 改性前后表面元素存在形态，结果如图4 7 所示。将分峰谱图4 和含碳官能团结合能对照可知，未经改性的ACF 表面C 元素主要以碳碳键形式存在，并存在部分碳氧双键和碳氮键。将分峰谱图5 和含氮官能团结合能对照可知，经 HNO3改性的 ACF 表面 N 元素存在形式主要为CN、NH2、OCONH和CNH2，也有部分以氧化的含氮官能团存在ONO(405 eV)、ONO2(406 eV)和NO2(407 eV)，其他改性ACF的 XPS 全谱图中均有 N1s 峰，为 ACF 吸附空气中的N2，为 N2峰。将分峰谱图 6 和含氧官能团结合能表对照可知，表面O 元素存在形式主要为COH 和NO2，且存在少量的碳氧双键。从分峰谱图 7 可知，经 FeCl3溶液改性的 ACF 表面 Fe 元素的结合形式主要为FeOOH。图4 未改性ACF表面C的分峰拟合谱图 Fig.4 Sub-peak fitting spectra of carbon on non-modified ACF 图5 HNO3 5 h改性ACF表面N 的分峰拟合谱图 Fig.5 Sub-peak fitting spectra of nitrogen on ACF modified by nitric acid 图6 HNO3改性ACF表面O 元素分峰拟合谱图 Fig.6 Sub-peak fitting spectra of oxygen on ACF modified by nitric acid 第4卷 第5期 2009 年 5 月 345 图7 FeCl3溶液改性ACF的Fe 元素XPS谱图 Fig.7 XPS of iron on ACF modified by FeCl3 2.2 改性ACF 对乳酸菌固定化的影响 2.2.1 ACF 表面酸性含氧官能团对其单丝菌膜厚度的影响 从图 8 可知，HCl 改性不同时间后的 ACF 单丝菌膜厚度，较之未经改性的 ACF（b（酸性含氧官能团）为0.33 mol/kg 和单丝菌膜厚度为5.5 m）无明显增加。从图9 中可知，适量的表面酸性含氧官能团，有助于增加 ACF 的单丝菌膜厚度。但是，当 b(酸性含氧官能团)大于0.87 mol/kg（改性时间5 h）时，单丝菌膜厚度有所下降，原因是酸性含氧官能团会使载体表面呈现出较强的负电性，与表面带负电荷的乳酸细菌产生排斥作用，使得 ACF 表面对乳酸细菌的固定化能力减弱。ACF 经H2SO4和HNO3改性5 h 时，其单丝菌膜厚度分别达到30.6 m 和31.2 m。2.2.2 ACF 表面 b(Fe()含量对其单丝菌膜厚度的影响 ACF 经 FeCl3改性，其表面 b(Fe()随改性时间增加而增加，并影响乳酸菌的单丝菌膜厚度。由图 10可知，随 ACF 表面 b(Fe()的增加，单丝菌膜厚度也增加。改性时间4 h时，ACF单丝菌膜厚度达到10.2 m，且乳酸菌膜厚度随b(Fe()一起达到负载饱和。图8 HCl改性时间对ACF表面单丝菌膜厚度的影响 Fig.8 Effect of modified time by HCl on single-silk biofilm thickness on ACF 图9 表面酸性含氧官能团对ACF表面单丝菌膜厚度的影响 Fig.9 Effect of surface acid oxygenic functional groups on single-silk biofilm thickness on ACF 2.2.3 HNO3-Fe()改性对ACF 单丝菌膜厚度的影响 通过单独的酸改性以及 FeCl3改性，ACF 对乳酸菌的固着作用较未改性的 ACF 均有所增强，实验进一步考察了酸改性与 FeCl3改性共同作用的影响，结果见图 11。图10 ACF表面b(Fe()对其单丝菌膜厚度的影响 Fig.10 Effect of content of iron ion on single-silk biofilm thickness on ACF 由图 11 可知，浓 H2SO4和 HNO3改性 5 h 后再经0.1 mol/L FeCl3改性4 h 的ACF 表面单丝菌膜厚度较之前有明显的增加，其原因在于ACF 表面获得的少量Fe元素，使 ACF 表面正电荷有所增加，利于乳酸菌的固着。经HNO3改性5 h 后再0.1 mol/L FeCl3改性4 h 的ACF 表面菌膜厚度达到 40 m。通过此方案改性后的ACF 用作乳酸菌载体，对淀粉工业废水乳酸发酵过程有着良好的促进作用。活性碳纤维表面硝酸-铁()改性对乳酸菌固定化的影响 第4卷 第5期 2009 年 5 月 346 中国科技论文在线 Sciencepaper Online ACF-1:未经改性的ACF;ACF-2:经FeCl3改性4 h的ACF;ACF-3:经H2SO4改性5 h再经FeCl3改性4 h的ACF;ACF-4:先经过HNO3改性5 h再经FeCl3改性4 h（HNO3-Fe()改性）的ACF 图11 HNO3-Fe()改性对ACF单丝菌膜厚度的影响 Fig.11 Synergistic effect of HNO3-Fe()on single-silk biofilm thickness on ACF 2.3 ACF 表面乳酸菌的显微观测 通过光学显微镜和扫描电镜(SEM)，对乳酸菌在ACF 表面的存在形态进行了观测，见图12 和13。从图可知，乳酸菌在载体 ACF 表面聚集成菌胶团，紧密的固着于ACF 表面，形成很厚的菌膜。ACF 的加入使得发酵体系中的乳酸菌生物量大大增加，发酵液中游离菌体减少，有利于后续的乳酸分离提取工艺。图12 光学显微镜下ACF单丝菌膜图 Fig.12 Picture of single-silk biofilm on ACF surface under optical microscope 图13 ACF表面乳酸菌存在形态SEM图 Fig.13 SEM photograph of lactobacillus on ACF 2.4 ACF 用作载体对乳酸发酵的影响 HNO3-Fe()改性的ACF用作淀粉生产工业废水发酵过程的乳酸菌固定化载体，实验还发现，ACF 载体的加入使得发酵液中乳酸产率增加，见图14。由图14 可知，ACF 作为载体时，乳酸生成量比未加载体发酵时提前约8 h 左右达到稳定。并且乳酸质量浓度稳定在43.5 g/L 左右，较无载体情况下的42.3 g/L乳酸产率提高了2.8%。图14 ACF用作载体对乳酸发酵过程的影响 Fig.14 Effect of ACF on lactic acid fermentation 3 结 论 本文建立了乳酸菌固定化载体ACF的HNO3-Fe()改性方法，取得如下研究结果：1)HCl 对ACF 表面特性无明显影响，而H2SO4和HNO3能改变 ACF 表面各元素及表面 b(酸性含氧官能团)。适量的表面酸性含氧官能团有助于ACF 的单丝菌膜厚度增加，经H2SO4和HNO3改性5 h 时，ACF 表面特性能很好地促进乳酸菌的固着。2)HNO3与FeCl3的协同改性使得ACF表面酸性含氧官能团增加的同时，表面正电荷也增加，这进一步有利于乳酸菌的固定化。在经过HNO3-Fe()改性后，ACF表面乳酸菌单丝菌膜厚度达到40 m。3)淀粉生产工业废水发酵制备乳酸试验中，经过HNO3-Fe()改性的 ACF 的加入使得发酵液中乳酸菌生物量增加，同时乳酸发酵周期缩短，稳定时间较未加载体情况下提前约8 h，乳酸产率提高约2.8%，该方法明显改善了淀粉生产工业废水乳酸发酵工艺。参考文献(References)1 赵鑫，赵良启，谢红.发酵生产 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