实验四--血涂片的制备与染色.doc

实验四 血涂片的制备与染色
【目的】 掌握血涂片的制备和染色方法(preparation aｎd staining　of tｈin ｂloｏｄ　films）。
【原理】 将一小滴血液均匀涂在玻片上,呈单层紧密分布,制成薄血片.用含天青Ｂ和伊红的Ｒomannowｓky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RＢC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色;细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合,染成淡紫红色.
【器材】
1.载玻片 使用前,必须仔细清洗,并用乙醇或软布清洁。
2.推片 选择边缘光滑的载玻片,在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。
３.吸耳球．
４．显微镜。
5.酒精灯或Bunseｎ灯.
6.采血针。
7．注射器和针头。
【试剂】
1．瑞氏(Wｒigｈt)染液
（1)Ⅰ液:包含瑞氏染料1。0g、纯甲醇（ＡR级以上）６0０mｌ、甘油15ml.将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨(至少３0min)，以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀,然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨,直至染料全部溶解,甲醇用完为止。再加15ｍl甘油密闭保存。
(2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液(ｐH6。４～６。8),包含磷酸二氢钾(KH２ＰO4）０.3ｇ、磷酸氢二钠（Na2HＰＯ4）０。2g、蒸馏水加至1０0０ml。配好后用磷酸盐溶液校正ｐH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。
2．吉姆萨染液 包含吉姆萨染料0.75g、甘油３5mｌ、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续４天,最后过滤备用.
3．瑞—吉复合染液
（1)Ｉ液:包含瑞氏染料1ｇ、吉姆萨染料0。3g、甲醇5０0ml、中性甘油10mｌ.将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中,加少量甲醇,研磨片刻，再吸出上液．如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3mｉn,共５d，以后存放１周即能使用。
（2）Ⅱ液：即磷酸盐缓冲液(pＨ6。4~6。8)。包含无水磷酸二氢钾6。6４ｇ、无水磷酸氢二钠２。5６g,加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ｍl.
【标本】　 EDTA抗凝静脉血或末梢血.
【操作】
1.采血 　
（1）静脉采血法:用ＥDTA·K２抗凝１～2h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cｍ处加1滴抗凝血,直径约4mm。
（２)皮肤采血法:选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数,再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备.
2．制作涂片 左手平执载玻片,或放在类似桌子等平坦地方,右手持推片从后方移动接近血滴,使血液沿推片边缘展开,将推片与载玻片呈30°～45°角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片(图1—12），血涂片应呈舌状,头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完.贫血病人推片速度要快.

图1-1２　 血涂片制备示意图

3．干燥涂片 　
(1）空气干燥：将推好的血涂片在空气中晃动,使其迅速干燥.
(2)加热干燥:握住涂片，在距离酒精灯或Ｂｕnsen灯火焰上方5０mm处晃动,但不能直接对着火焰.
4．标记涂片 在载玻片的一端用记号笔编号,注明患者姓名或门诊/住院号。
５.染色
(1)瑞氏染色法:待血涂片干透后,用蜡笔在两端画线,以防染色时染液外溢.然后将玻片平置于染色架上，滴加染液（I液）3~5滴，使其迅速盖满血涂片，约0.５～1miｎ后，滴加等量或稍多的缓冲液(Ⅱ液)，轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合．5～１0min后用流水冲去染液,待干。
(2)吉姆萨染色法：将固定的血涂片置于被pH6。4~6。8磷酸盐缓冲液稀释1０～2０倍的吉姆萨染液中，浸染10~３0min（标本较少可用滴染).取出用流水冲洗,待干燥后显微镜检查.
(3)瑞一吉复合染色法:操作步骤同瑞氏染色法，只是染色时将瑞一吉复合染液Ⅰ液和Ⅱ液替代瑞氏染液的Ⅰ液和Ⅱ液。
６．观察结果 将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色;血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒;单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色.
【注意事项】　
1.瑞氏染液 新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差,经在室温下贮存一定时间,美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多,染色效果愈好,但必须盖严瓶口,以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AＲ(无丙酮).染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发,使细胞染色较清晰．
２.采血
（１）不能采集以下部位的血液：①示指或拇指血液。②感染部位血液,如甲沟炎.③耳垂部位血液，含单核细胞太多。
(2)不能使用肝素抗凝标本。
（3）玻片必须清洁、干燥、无尘.①新玻片：应在清洁液中浸泡过夜,然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗.②已用过的玻片：应在６0℃清洁液中加热20min，然后用水冲洗,最后用蒸馏水冲洗。③边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。
(4)使用玻片时,只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。
３.制作涂片　　许多因素可影响血涂片的厚度,针对不同患者应有的放矢,对血细胞比容高、血粘度高的患者应采用小血滴、小角度、慢推;而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。涂片质量不佳及可能原因见表1－1，图1-1３.

表１—1 涂片质量不佳及可能原因
涂片质量不佳
可能原因
不规则间断和尾部太长
推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏
有空洞
载玻片污染脂肪、油脂
白细胞和血小板尾部分布不规则
制片技术差
涂片太长或太短
推片角度不佳
涂片没有尾部
血滴太大
涂片很短
血滴太小
涂片没有边缘空隙
推片太宽
有细胞退变现象
固定延迟、固定时间太短、甲醇污染
血涂片厚
血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快
白细胞破损
推片时用力过猛

图1－１3 　血涂片质量比较
(A为涂片质量好,B、Ｃ、D、E、F、G、H、I为涂片质量差)

４.干燥涂片 血涂片干透后方可固定染色,否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上,在染色过程中容易脱落。
5．染色步骤
(1）操作注意事项及操作不当的后果见表1－3。

表１-2 染色操作注意事项及操作不当的后果
操作注意事项
操作不当的后果
加染液应适量
过少则易蒸发沉淀,一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细胞深染不易检查。
冲洗时不能先倒掉染液,应以流水冲洗
染料沉着在血涂片上
冲洗时间不能过久
脱色
冲洗完的血涂片应立放于支架上
剩余水分浸泡脱色

（2)染色时间与染液浓度室温及细胞多少有关.染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间.冲洗前,应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚,核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间,特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液,均需试染,以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。
6.结果观察　 低倍镜下观察血涂片应厚薄适宜,细胞不重叠，头尾及两侧有一定的空隙,一些体积大的特殊细胞常在血涂片的尾部出现。如有可能,干燥后的血涂片先用中性树胶封片后再观察，不仅能长期保存血涂片,而且观察效果更佳。染色质量不佳及原因见表1—3。

表1-3 染色质量不佳及可能原因
染色效果
可能原因
纠正措施
太蓝
涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳光
在含1%硼酸的９5%乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检
太红
冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片
规范操作。新鲜配置中性水．保证染液质量不佳
太淡
染色时间太短、冲洗时间太长
复染。应先加缓冲液,后加染液,或加染液与缓冲液的混合液,不可先加染液
染料沉积
染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏
用甲醇冲洗2次,并立即用水冲掉甲醇,待干后复染
蓝色背景
固定不当、涂片未固定贮存过久、使用肝素抗凝剂
注意涂片的固定．使用EDTA抗凝静脉血