菠萝蛋白酶和TG酶对猪肉水解度_失水率的影响.pdf

134薛力荔1，杨胜荣1，朱秋劲1，2，*(1.贵州大学生命科学学院食品系，贵州贵阳 550025;2.贵州大学食品科学工程研究中心，贵州贵阳 550025)摘要:以猪肉糜为原料，用菠萝蛋白酶酶解后，再添加 TG 酶对其进行交联，采用 L9(34)正交实验，以水解度和失水率为考察指标，研究 TG 酶对酶解后的猪肉糜营养物质的捕集能力及品质影响。结果表明，添加 TG 酶的猪肉糜水解度和失水率比不添加的明显降低，水解度从 5.76%降到 4.04%，失水率从 23.64%降到 9.38%。由正交实验得出，影响因素的主次关系为加酶量 作用温度 作用时间，TG 酶添加量 0.5%，作用温度 35，作用时间 1h，猪肉糜的水解度和失水率都是最低的。关键词:菠萝蛋白酶，TG 酶，交联，水解度，失水率Effect of bromelain and TGase on degree ofhydrolysis and rate of water loss of porkXUE Lili1，YANG Shengrong1，ZHU Qiujin1，2，*(1.Department of Food Science，College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China;2.Food Science Engineering Research Center，Guizhou University，Guiyang 550025，China)Abstract:Took the pork as the material，and then coss linked it using TGase after enzymolysis by bromelain.Themain examine items were the degree of hydrolysis and the rate of water loss，while using the L9(34)orthogonalexperiment to investigate the quality influence of Transglutamianse to the pork.The experimental result showed thatthe degree of hydrolysis and the rate of water loss of the pork which adding the TGase were lower than thosewithout TGase，and the degree of hydrolysis fell from 5.76%to 4.17%，the rate of water loss fell from 23.64%to12.45%.At last orthogonal experiment showed that the order of the primary and the subsidiary factors were:thequantity of enzyme the reaction temperature the reaction time.When the quantity of TGase adding was 0.5%，thereaction temperature was 35，after 1h reaction，the degree of hydrolysis and rate of water loss of the pork was thelowest.Key words:bromelain;transglutamianse;cosslinking;degree of hydrolysis;rate of water loss中图分类号:TS251.5+1文献标识码:A文 章 编 号:10020306(2011)09013405收稿日期:20100825*通讯联系人作者简介:薛力荔(1987)，女，在读硕士，研究方向:畜产品加工。基金项目:国家科技支撑计划专题(2007BAD53B03);贵州省农业攻关项目黔科合 NY 字(2009)3029 号。目前，蛋白酶已普遍用于肉制品加工中。肉通过蛋白酶的适度降解可以变得柔嫩多汁，口感更好，还能加速肉制品成熟和风味的形成1。Ansorena2 将脂酶 Palatase M.和蛋白酶 Protease P.同时添加到发酵香肠中，发现部分游离氨基酸和游离脂肪酸的含量增加。Zapelena 等3 发现金属蛋白酶Neutrase 能促进干发酵香肠的蛋白水解而不会造成产品软化。Hagen4、Naes5 在发酵香肠中添加蛋白酶制剂使其成熟时间缩短。罗珺等6 发现木瓜蛋白酶能促进腊肉中蛋白质的降解，对腊肉风味的形成有一定促进作用。但酶解也带来了一些问题。蛋白酶将蛋白质分解成肽段和氨基酸等小分子物质7，肉蒸煮时，这些小分子物质容易流失，造成大量的蛋白质损失并降低肉品的保水性能。若蛋白酶过度降解，肉质会非常柔软，食用品质变差。谢超8 发现目前所用的酶类由于具有广泛的底物专一性，易导致肉过嫩，空间结构坍塌，对风味、质地评价造成负面影响。谷氨酰胺转胺酶(EC 2.3.2.13，transglutamianse，TG)是一种催化酰基转移反应的转移酶。它能使蛋白质与蛋白质、蛋 白 质 与 氨 基 酸 之 间 发 生 交 联 反 应，形 成(谷氨酰)赖氨酸键，从而改变蛋白质的结构和功能性质9，提高其营养价值和保水性1011。吴立根12 发现添加谷氨酰胺转氨酶的鸡肉，其质构、保水135性、风味和口感都有所提高。江波13 等发现添加谷氨酞胺转氨酶后火腿肠组织的凝胶破坏力和凝胶强度有所提高。本研究以猪肉糜为研究对象，先经菠萝蛋白酶酶解嫩化后，再通过 TGase 的交联作用，以水解度及失水率为考察指标，旨在了解菠萝蛋白酶与 TGase 协同作用对猪肉品质的影响，为开发新型肉制品提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器新鲜猪肉来自背最长肌部位，购于贵阳市花溪区学士路农贸市场;菠萝蛋白酶(50 万 U/g)、谷氨酰胺转氨酶(TGA02)广西南宁庞博生物工程有限公司，食品级;甲醛汕头市西陇化工厂有限公司，分析纯;氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、乙醇、硼酸天津市致远化学试剂有限公司，分析纯;甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯。FA2004N 电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司;MT688 多功能食物加工机顺德市爱德实业有限公司;TGL20M 台式高速冷冻离心机长沙迈佳森仪器设备有限公司;DK98A 电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司;pH3C 精密 pH 计上海虹桥仪器仪表有限公司;JJ1 定时电动搅拌器江苏金坛市中大仪器厂;CLHN350T 恒温恒湿箱天津市华北实验仪器有限公司;移液器大龙医疗设备有限公司;压力计自制;KDN04A 定氮仪上海昕瑞仪器仪表有限公司。1.2实验方法1.2.1样品处理取新鲜猪肉，去除脂肪组织及结缔组织，将肉切成 2cm 2cm 2cm 左右大小的肉块，用绞肉机绞成肉糜。按照前期实验所得结果，取(100 0.2)g，按 0.2mg/g 的浓度添加菠萝蛋白酶进行酶解嫩化，15 处理 1h 后再按不同条件添加 TG酶进行交联。1.2.2单因素实验1.2.2.1添加量对 TG 酶作用的影响TG 酶添加的浓度分别为 0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1%，加酶后的作用温度为 35，作用时间 1h。1.2.2.2反应温度对 TG 酶作用的影响TG 酶用量为 0.5%，作用温度分别为 5、15、25、35、45，作用时间 1h。1.2.2.3时间对 TG 酶作用的影响TG 酶用量为0.5%，反应温度为 35，对猪肉保温作用分别为 0.5、1、1.5、2、3h。1.2.3正交实验采用 L9(34)正交实验设计，实验因素及水平设计如表 1 所示。表 1L9(34)正交实验因素水平表水平因素A TG 酶用量(%)B 温度()C 时间(h)10.315120.5251.530.83521.2.4测定方法1.2.4.1氨基酸态氮的测定1415 按国标 GB/T5009.402003 酱卫生标准的分析方法与酱油卫生标准的分析方法执行。1.2.4.2总 氮 的 测 定16 按 照 GB5009.5 2010执行。1.2.4.3水解度先通过以上方法测出氨基酸态氮与总氮的含量，再由下列公式算出水解度，计算公式见式(1)17:水解度(DH)=肉样中氨基酸态氮含量肉样含氮量式(1)1.2.4.4失水率的测定采用压力法。称取 10g 左右的肉样，用感量为 0.001 的天平称重后置于两层纱布间，上下各垫 12 层定性滤纸。滤纸外各垫一块铁板，然后放置于改装钢环允许土壤膨胀压缩仪上，用匀速摇动使加压至 35kg，保持 5min，撤除压力后立即称量肉样重，失水率按式(2)计算18:失水率(%)=m1m2m1100%式(2)式中:m1为加压前肉样重;m2为加压后肉重。1.2.5统计分析实验数据应用 SPSS11.5 统计软件，正交结果应用正交设计助手3.1 专业版分析。2结果与讨论2.1TG 酶浓度对肌肉失水率及蛋白质水解度的影响从图 1 可以看出，不同浓度的 TG 酶添加量对猪肉糜的水解度及失水率都有影响。猪肉糜经菠萝蛋白酶酶解后，再添加 TG 酶交联，水解度比不添加 TG酶的明显降低(P 0.05)，随着 TG 酶浓度的增加，水解度逐渐降低，当添加量为 0.5%时猪肉糜的水解度达最低值 26.77%，与各组差异显著(P 0.05)。这也说明，添加 TG 酶的氨基酸态氮比不添加 TG 酶的低，TG 酶浓度 0.5%时最低。但 TG 酶浓度在 0.5%后，肉糜水解度有升高的趋势，到 0.5%时水解度最低，但随后水解度增高，即氨基酸态氮增高。徐辉19 在研究秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶时，TG 酶浓度为0.5%时，交联程度比较高，网络孔洞大小、形状和分布比较均匀。从图 1 中还可以看出，猪肉糜的失水率随 TG 酶浓度的增加而降低，添加量在 0.1%至 0.8%之间，失水率比仅酶解的(23.64%)有所提高，而当浓度为1.0%时，失水率达到 12.45%，反而比不添加的低。这个趋势与吴立根等12，20 的研究相似。图 1TG 酶浓度对肌肉水解度、失水率的影响注:大写字母表示水解度的差异性，小写字母表示失水率的差异性;不同字母表示差异显著(P 0.05);图 2、图 3 同。136TG 酶浓度对肌肉失水率及蛋白质水解度的影响，经菠萝蛋白酶酶解后的猪肉糜，再添加 TG 酶交联后，水解度及失水率都有所变化。添加 TG 酶后，各浓度条件下水解度都比不添加 TG 酶的显著降低(P 0.05)。说明猪肉糜中氨基酸态氮有所降低，原因可能是由于菠萝蛋白酶酶解时，将肉中蛋白质降解成小分子多肽甚至氨基酸21。TG 酶将酶解出来的小分子物质与蛋白质交联，改变了蛋白质的网络结构，也束缚了一些小分子物质，因此氨基酸态氮含量降低。添加 TG 酶后，猪肉糜的失水率随浓度增加而降低。TG 酶浓度在 0.1%到 0.8%时，失水率比只经酶解的高，当浓度升高到 1.0%时，失水率显著降低(P 0.05)，甚至低于仅酶解过的猪肉糜。原因可能是由于猪肉糜先由菠萝蛋白酶嫩化，内部结构疏松，在添加 TG 酶后，低浓度 TG 酶催化效率低，蛋白质之间不能交联，蛋白质与小分子物质之间交联作用不强，形成的网状结构不足以稳固经酶解破坏的蛋白质结构，网孔的保水性低。反之，当 TG 酶浓度增高时，蛋白质形成紧密的网状结构，提高了猪肉糜的保水性能。2.2不同温度条件下 TG 酶对肌肉失水率及蛋白质水解度的影响从图 2 中可以看出，添加 TG 酶的猪肉糜水解度随着处理温度的升高逐渐降低，25 到 45 变化趋势趋于平缓，差异不显著(P 0.05)。同时，随着处理温度的升高，猪肉糜失水率呈逐渐上升的趋势，但总体差异不显著，只有 5 与 45 差异显著(P 0.05)，失水率分别为 32.44%、50.90%。吴立根13 在研究 TG 酶对鸡胸肉失水率的影响时也得到，随作用温度升高失水率逐渐增高。实验还发现，肉色随温度的升高逐渐由红色变为白色，到 45时肉色全白，已不能作为生肉原料，舍弃此温度点。图 2TG 酶作用温度对肌肉水解度、失水率的影响随着处理温度的升高，添加 TG 酶的猪肉糜水解度逐渐降低。随着作用温度的升高，TG 酶的催化效率增强，提高了氨基酸等物质与蛋白质的结合能力。同时，猪肉糜失水率随着处理温度的升高呈上升的趋势。而陈海华等18 在研究 TG 酶凝胶化温度对竹荚鱼鱼糜凝胶失水率的影响时，结果显示，在 45以下温度，失水率随温度的升高而降低。本研究与其结果不一致，这可能是因为猪肉糜先经过菠萝蛋白酶在 15下酶解处理 1h，再添加 TG 酶交联由于肉中还留有菠萝蛋白酶，两种酶的最适作用温度范围相近，都在 50左右19，22，随着处理温度的升高，催化效率都在增强，酶解与交联共同作用于猪肉糜，使得内部结构有所改变，导致失水率与前者不一致。2.3不同时间条件下 TG 酶对肌肉失水率及蛋白质水解度的影响从图 3 中可以看出，作用时间小于 1.5h 时，随着TG 酶作用时间的延长，猪肉糜的水解度呈下降趋势，1.5h 达到最低值 3.91%。而从 2h 到 3h 时水解度有所升高，但两个变化趋势都不显著(P 0.05)。随着作用时间的延长，猪肉糜的失水率逐渐降低。这主要是因为延长 TG 酶的交联时间，有利于 TGase 对蛋白质底物的充分作用有利于蛋白质间形成(谷氨酰胺基)较多赖氨酸共价键18，把更多限制性氨基酸共价交联到蛋白质上，因而降低了猪肉糜的水解度。TG 酶的交联作用使肌肉蛋白形成较为复杂的网状结构，提高了肌肉的保水性，即降低了其失水率。图 3TG 酶作用时间对肌肉水解度、失水率的影响2.4多重因素对肌肉失水率及蛋白质水解度的影响表 2 为猪肉糜水解度与失水率正交实验结果分析表。从表 3 中的方差分析可看出，TG 酶浓度对猪肉糜水解度有显著影响(P 0.05)。当 TG 酶浓度为0.5%时，水解度达最低值 4.153%，浓度为 0.8%时水解度最高(4.773%)。处理温度与处理时间对水解度均无显著影响(P 0.05)。极差分析结果(表 2)显示，各因素对水解度影响的主次顺序为:TG 酶浓度处 理 温 度 处 理 时 间，水 解 度 最 优 水 平 为:A2B3C3，即 TG 酶添加量(A)为 0.5%，处理温度(B)为 35，处理时间(C)为 2h 条件下处理猪肉糜，水解度最低。而处理温度和处理时间不显著。考虑到节省时间，在实际应用中，选择时间为 1h。由方差分析结果(表 3、表 4)可知，TG 酶浓度、处理温度、处理时间对失水率的影响均不显著(P 0.05)。极差分析结果(表 2)显示，各因素对失水率影响的主次顺序为:TG 酶浓度 处理温度 处理时间，失水率最优水平为:A3B2C2，即 TG 酶添加量(A)为 0.8%，处理温度(B)为 25，处理时间(C)为 1.5h条件下处理猪肉糜，失水率最低。表 3正交结果方差分析表(以水解度为考察指标)因素偏差平方和自由度F 比F 临界值显著性A0.604235.52919.000*B0.06223.64719.000C0.02521.47119.000误差0.022综合两个指标得出的正交实验优化结果及其显著性影响，并从成本、便利等方面综合考虑，建议条137表 2猪肉糜水解度与失水率正交实验结果分析表实验号ABC水解度(%)失水率(%)11(0.3)1(15)1(1)4.37 0.12cd17.31 1.32ab212(25)2(1.5)4.44 0.11bcd14.77 1.52bc313(35)3(2)4.23 0.10de18.91 1.66a42(0.5)124.24 0.30de13.22 2.05cd52234.18 0.23de11.07 2.32cde62314.04 0.11e9.38 1.90e73(0.8)134.64 0.12bc12.12 2.39cde83214.97 0.10a10.81 1.10de93324.71 0.20ab9.4 3.95deK14.347b/16.997a4.417a/14.217a4.460a/12.500aK24.153cb/11.223b4.530a/12.217a4.463a/12.463aK34.773a/10.777b4.327a/12.563a4.350a/14.033aR0.620/6.2200.203/2.0000.113/1.570优水平A2/A3B3/B2C3/C2主次顺序A B CA B C注:同列数据不同字母表示差异显著(P 0.05)。件为:TG 酶添加量 0.5%，处理温度 35，处理时间1h，即表2 中的6 号实验，在此条件下处理猪肉糜，水解度值从 5.76%降低到 4.04%，失水率从 23.64%降低到 9.38%。表 4正交结果方差分析表(以失水率为考察指标)因素偏差平方和自由度F 比F 临界值显著性A72.21928.85619.000B6.85420.84019.000C4.81720.59119.000误差8.1523结论3.1单因素实验得出，经菠萝蛋白酶、TG 酶处理过的猪肉糜，水解度及失水率都有所变化。两种酶处理后的肉样水解度比仅用菠萝蛋白酶处理的低。此外，猪肉糜经两种酶处理后，失水率随 TG 酶浓度的增加而降低。添加 TG 酶后，处理温度和处理时间对猪肉糜水解度和失水率也有所影响。随着处理温度的升高，猪肉糜水解度逐渐降低，而失水率逐渐升高。随着处理时间的延长，水解度和失水率都呈逐渐降低的趋势。3.2由正交实验得出，TG 酶浓度对水解度及失水率的影响最显著，处理温度及处理时间在本实验设定水平上对水解度和失水率的影响都不显著。从成本、便利等方面综合考虑，TG 酶处理条件可选择:TG酶添加量 0.5%，处理温度 35，处理时间 1h，此时水解度为 4.04%，失水率为 9.38%。参考文献 1 张红梅，范贵生，孙宝忠.蛋白酶在发酵香肠成熟中的作用及机理 J.肉类研究，2007(4):2223.2Ansorena D，et al.Simultaneous Addition of Palatase M andProtease P to a Dry Fermented Sausage Elaoration Effect OverPeptidic and Lipid FractionsJ.Meat Science，1998(50):3744.3Zapelena M J，et al.Effect of the Addition of a NeutralProteinase from Bacillus subtilis(Neutrase)on Nitrogen Fractionsand Texture of Spanish Fermented Sausage J.Jouranl ofAgricultural and Food Chemistry，1997，45(7):27982801.4Hagen B F.Bacterial Proteinase Reduces Maturation Time ofDry Fermented Sausages J.Food Science，1996，61(5):1024.5Naes H，et al.Accelerated ripening of dry fermented sausageby addition of a Lactobacillus proteinaseJ.International ofJournal of Food Science and Technology，1994，29(6):651.6 罗珺，崔建云，陈尚武，等.添加木瓜蛋白酶对腊肉风味的影响研究 J.肉类研究，2005(10):2528.7 王炜，李洪军.外源性添加剂对川式发酵香肠的品质影响 J.肉类工业，2005(9):1923.8 谢超，刘鹭.几种肉类蛋白酶嫩化剂的比较 J.肉类工业，2003，262(2):2931.9MOTOKI M，SEGURO K.Transglutaminase and its use forfood processingJ.Trends in Food Science and Technology，1998，9(5):204210.10 刘汉灵，韦梅，杨彩菊.高效谷氨酰胺转胺酶(TG 酶)产品在食品加工中的应用J.中国食品添加剂，2008(2):253254.11 ZhuY，RinzemaA，TramperJ，etal.Microbialtransglutaminase a review of its production and application infood processing J.Appl Microbiol 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可以看出，苍耳根和茎乙醇提取物对大肠杆菌具有最强抑制作用，苍耳叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和酵母菌抑制作用最强，苍耳子乙醇提取物对微球菌抑制最强。3结论从苍耳各部位三种提取方式的抑菌活性看，各种提取方式对各种菌的抑制活性有较大差异，去离子水和酸水的提取物抑菌效果有一定的相似性;苍耳茎叶提取物的抑菌谱和抑菌活性有相似性。从各部位的抑菌效果来看，为历代医书收载的苍耳子并没有表现出比其它部位更强的抑菌效果，除放线菌外，对其它菌种有较强抑制活性部位均不在苍耳子部位，这预示着苍耳这种药材应该有更广泛的开发前景。因此，从抗菌角度来看，苍耳各部位不同方式提取物对受试菌均有不同程度抑制作用，各部位中苍耳叶的不同方式提取物表现出较宽抑菌谱和较强的抑菌作用，具有相对较大的开发潜质。参考文献 1 吕益涛，侯海宫，苏耀海，等.苍耳属植物的鉴别研究 J.中国中药杂志，2001，26(1):1720.2 国家药典委员会编.中华人民共和国药典M.北京:化学工业出版社，2005:111112.3 朱庆书，朱兆友，赵星星.苍耳子油提取工艺的比较研究 J.青岛科技大学学报:自然科学版，2009，30(6):495497.4 王荧荧，冯紫薇，高天.苍耳子辛夷合煎液指纹图谱变化分析 J.长春中医药大学学报，2009，25(6):829831.5 王如阳，刘晓芳，刘满红，等.苍耳子提取液的抗氧化活性研究与总黄酮含量测定 J.云南中医中药杂志，2008，29(9):4243.6 黄文华，余竟光，孙兰，等.中药苍耳子化学成分的研究 J.中国中药杂志，2005，30(13):10271028.7 钱之玉.药理学实验与指导M.北京:中国医药科技出版社，1996:230232.8 李全林，朱桂芳.复方苍耳子油剂治疗鼻窦炎 98 例 J.陕西中医，2009(12):1644.9 刘颖，吴中明，兰萍.苍耳子提取物抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研究 J.2009，20(7):17761777.10 Ahuja M M，Nigam S S.Chemical examination of essentialoil from the leaves of Xauthium strunmrium(Linn)J.FlavInd，1970(1):627628.11 Steenkamp P A，Harding N M，van Harden F 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