侧脑室注射.doc

侧脑室注射一、大鼠侧脑室注射（需定位器）SD大鼠，侧脑室的坐标是以前囟点为中心定好坐标，旁开1。5mm,向后囟方向1。1mm ，深4.5mm。一、实验器具和药品（一）器具小号的注射用针头(外径为0.7mm，内径为0.5mm,要磨平，磨光滑，长度大概为1cm,中间套有一小的塑料垫片,以便固定），不锈钢的细铁丝（长度大概为1.2-1.5cm，要求与小号针头的内径相一致，用作导管外的塞子，外面套有与小号的注射用针头粗细一致的塑料，用作塞帽,便于打开），小号螺钉(固定用）和螺丝刀,剪毛剪，镊子，眼科剪（镊),手术刀片（柄)，小号注射器,注射针头，烧杯,铝饭盒,手术灯,墨水(作标记），棉签，酒精棉球（二）药品生理盐水，青霉素，戊巴比妥钠，H2O2，502胶水，义齿基托树脂，义齿基托树脂液II型二、实验动物健康的成年大鼠,体重在170200g，动物手术前在实验室条件下适应性饲养1周,并于手术前称重，以确定麻醉剂用量。三、实验步骤（一）、麻醉麻醉剂为戊巴比妥钠溶液,浓度为20mg/ml，腹腔注射.体重在170-200g的成年大鼠,注射剂量为0.65ml/只，即可保证整个实验过程动物一直安静。（二）、固定1、在一水平桌面上，水平调整好立体定向器（江弯I型C)，包括水平上的左右2根钢针、前面的牙齿固定针以及上方的钢针部分。要求左右2根钢针在一水平线上，左右距离一致，牙齿固定针部位水平,与左右2根钢针在一水平面上，并且与左右2根钢针的尖端连接处形成一个等边三角形.上方钢针保持垂直，其尖端处与牙齿固定处以及2耳蜗连线的中点在同一个竖直平面上。立体定向器的中空部分用一个空的形状适宜柔软的纸盒垫平,位置与底座左右2根坐杆齐平。2、将已麻醉的动物（大鼠）水平并以俯卧的姿势置于盒子的上方，并使水平上的左右2根钢针的尖端刚好对准耳蜗,先将牙齿卡好，然后慢慢的旋紧水平钢针，使之尖端缓缓的伸进耳蜗（一边一边进行），直至松紧适宜,整个头颅水平固定，不能摇动为止（可从定向器前方察看）。（三)、安装步骤1、在头颅的正中部位术野处剪毛,大小适宜，用酒精棉球搽拭，消毒后，以左右耳蜗的连线为基线(稍微向前一点点），以头颅中轴为方向,沿头部用刀片切开一小切口（0.51cm左右），深度适宜（先只需切开皮肤，切勿伤及颅盖）,用棉签蘸去流出的少量血液,然后用眼科镊(剪）轻轻挑起并剪开皮下筋膜，并稍微做钝性分离，直至暴露颅盖,用棉签蘸去流出的少量血液。2、 用棉签蘸取适量的10 H2O2，在颅盖表面轻轻搽拭，消毒。3、确定安装导管的位置。导管安装在侧脑室（单侧）.解剖位置为：前骨缝的交点处即前囱沿着中骨缝向后0。8mm，然后水平离中骨缝靠右1。5mm的位置。4、先用大号的注射针头(尖端蘸点墨水，好做标记）在前囱的位置处做一标记（打一小孔眼），然后在定向器上方钢针的顶端安上一小的锋利的注射针头(尖端蘸点墨水，好做标记），并调整好位置，使针头慢慢的靠近前囱的位置，待吻合后，然后微调定向器上方的旋钮(前后刻度刚好和导管安装的位置相吻合)，使上方钢针上的针头的位置刚好对准导管安装处的位置，然后微调定向器最上方的旋钮，使上方钢针上的针头慢慢靠近导管安装位置，并在导管安装位置上打一小孔眼，同时也作好导管安装处的标记。然后慢慢的移去针头，但是上方钢针的位置已经调整好了，切勿移动.5、用一钝性针头在先前已经作好标记的前囱的位置处先钝性扩大一下孔眼，然后将一细小的螺钉，沿着孔眼慢慢的旋转使之进入适宜的深度后，用502胶水将螺钉固定在颅盖上（螺钉最好是垂直固定）。同时，用一钝性针头在先前已经作好标记的安装导管的位置处先钝性扩大一下孔眼,以便导管容易进入.6、将事先已经磨好的并且已经安上相匹配塞子的导管安装在定向器上方钢针的顶端，固定好后，慢慢的旋紧旋钮,使导管顶端慢慢的接近导管安装的位置，待位置吻合后，慢慢的旋紧定向器最上方的旋钮，使导管最顶端慢慢的伸入侧脑室，直至到达侧脑室位置（大概在颅骨以下4.5mm处）,松紧适宜.7、倒取适量的专用固定剂于一小瓶盖上（义齿基托树脂，上海二医张江生物材料有限公司,电话[phone]），然后滴加适量的义齿基托树脂液II型（自疑牙托水，上海二医张江生物材料有限公司），混合均匀后,用钝针头慢慢吸取树脂液，均匀涂于刚安装上的导管的周围,以及前囱位置上的螺钉的周围，使之相互粘连和固定.8、慢慢的旋开定向器上方钢针侧边的旋钮，使之与导管松开，然后慢慢的旋转定向器最上方的旋钮，使之与导管脱离后，移开.此时,导管外端完全暴露，然后在导管的周围均匀涂上树脂液,厚度适宜，并且使之与周围的皮肤粘合完整，封闭，自然晾干。（在这个过程中，一定要保证导管没有摇动，否则导管进口处可能不封闭)9、吸取适量的青霉素溶液(约0.2ml）,腹腔注射。10、慢慢的松开耳蜗里的2根钢针和牙齿固定针,将动物放回笼子，稍待片刻后，动物自然舒醒。11、手术后的动物要注意观察其行为变化,手术部位有无液体流出以及是否有红肿和感染,如有,则要进行护理和消炎处理。动物每天注射青霉素（约0。2ml），2次/天，连续注射3天.保证笼子四周平整，以防动物将导管刮坏（掉)。待手术恢复正常后（一般为12W）,即可用于实验研究。二、小鼠侧脑室注射（定位器）1材料与方法11实验动物与分组SPF级雄性小鼠60只，78周龄,体质量2226 g，实验分两部分进行:第一部分，分为传统埋管组和实时纠偏埋管组2组，每组10只,进行两种埋管法成功率比较:第二部分，使用实时纠偏埋管法埋管，然后分为5、10、20、30 ul四个注射剂量组，每组10只小鼠.12实验器材实验中使用ALCH电动数显动物脑立体定向仪、ALC-IP600型微量注射泵ALCCED8型动物颅骨钻（以上均由上海奥尔科特生物科技有限公司生产),埋置套管使用25 ml无菌注射器针头自制，内芯使用相配不锈钢丝自制，与套管适配的PE管、内注射针及直径1 mm、长度2 mm的固定用螺丝（购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。自凝牙托水和牙托粉均为市购。实验用螺丝、套管等与小鼠体内接触器材采用新洁尔灭浸泡消毒。13手术方法方法如下：（1）采用戊巴比妥钠(浓度7。5mg/ml)0。1ml/10g腹腔注射麻醉小鼠；(2) 小鼠头顶部剃毛，固定于脑立体定向仪，调节门齿杆，使其顶部呈水平状；(3) 头顶皮肤消毒后沿中线切开,剥离筋膜，以无菌棉签蘸少量双氧水涂擦颅骨表面，暴露Bregrna（前囟）点;(4) 根据Paxinos等所著小鼠脑立体定位图谱选择侧脑室定位坐标为前囟后0.6mnl，旁开1.5mm，深1。7 mm(进针深度以硬脑膜为起始点）；(5) 操作脑立体定向仪使其定位在Bregma点，按所选取坐标在颅骨顶标记钻孔位置，使用0.8mm直径钻头钻孔，钻孔以打通顶部颅骨且不伤及硬脑膜和脑实质为标准；(6) 在矢状缝与人字缝交点右侧约1。52mm处钻一浅孔（未钻通颅骨）,留待固定螺丝；(7) 传统埋管法，按照所选坐标埋置套管至硬脑膜下1.7mm处。实时纠偏埋管法，将欲埋置的套管连接一段长1520 cm PE管(图2）其内充满人工脑脊液或生理盐水，同样埋置套管至硬脑膜下1.7mm，然后使PE管竖直，看其中液面是否有下降,下降即为进入侧脑室，若液面不下降则说明未进入侧脑室，则可小范围调整埋管深度，直至液面下降为止；(8) 将螺丝固定于预留浅孔内，使其与颅骨连接稳固；(9) 用牙托水和牙托粉将套管、螺丝、颅骨紧密粘合，凝固后松开固定套管的装置，轻柔取下PE管，并插入套管内芯;(10) 颅顶撒入青霉素干粉，缝合皮肤切口；(11) 小鼠单笼饲养恢复1周。14判断套管进入侧脑室方法 实验第一部分在套管埋置之后可以立刻用连接微量注射泵的内注射针以2ulmin的速度注射5ul的0。1%溴酚蓝染料，静置10 min,抽出注射针，对小鼠施行安死术后取脑，沿进针的冠状面切开，若脑室内充满蓝色染料,则说明侧脑室埋管成功，否则为不成功。15侧脑室注射剂量设置埋置套管的小鼠恢复1周后进行第二部分实验即注射剂量研究。使用连接微量注射泵的内注射针以2ulmin的速度向侧脑室注射人工脑脊液(小鼠侧脑室埋管给药方法的优化)三、小鼠侧脑室注射(非定位器）1。使用小鼠的品系：昆明系小鼠；2.抓的位置：颈部的皮肤，并向下按住,尽量使小鼠的头不能乱动；3.打药的位置：定位的标准是两个眼珠的连线(原因是眼珠不会随着头部皮肤的移动而移动，眼珠是固定在小鼠的头上,所以其连线和侧脑室的相对位置是固定的-这也是本人宝贵的经验之一），以眼间连线的中点为起点,垂直于眼间连线后移3-4mm,然后侧移1.1mm左右，向下3mm左右，即进入侧脑室;最好用亚甲基蓝染液预先做一下定位实验。当然准确性要多练练.4.打药的剂量：10ul的微量注射器垂成45度角刺入入颅骨进入脑室3mm，注射剂量是3ul,打药时间30s左右,打药之后再停留十几秒,然后慢慢的拔出注射器针头。打药位置可向侧脑室中注射墨水的方法来检测,如果位置正确，取出脑组织，进行冠状切片，可以发现墨水能顺着侧脑室向后扩散进入第三脑室，第四脑室,导水管；并且此方法也能帮助你看清侧脑室的形状,进行准确的定位。