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生物化学实验操作手册862020年4月19日文档仅供参考总 论目录第一篇 生物化学实验基本操作、基本技术及原理5第一章 生物化学实验基本操作5第二章 实验样品的制备12第三章 分光光度法14第四章 层析法18第五章 电泳法28第二篇 基础生物化学实验35实验一 蛋白质的定量测定Folin-酚法35实验二 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)41实验三 酵母核糖核酸（RNA）的提取50实验四 酵母核糖核酸（RNA）组分的鉴定52实验五 核酸的定量测定紫外(UV)吸收法56实验六 过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定58实验七 维生素C的定量测定（2.6-二氯酚靛酚滴定法）62实验八 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较69实验九 血糖的定量测定（GOD-PAP法）7221世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科,它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。 生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。 本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其它专业课程和进入科学研究领域的准备。 一、实验要求 1实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。 2实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。 3实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。二、实验时注意事项 1进实验室要穿好实验服，以免酸碱腐蚀衣服。 2进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。3要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐,按次序放置。实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。 4实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹 ，不得随地吐痰，乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。5要爱护仪器、节约药品。第一次实验时要按仪器清单清点仪器，负责保管，用后如数交还,在使用时如有破损，及时报告，经指导教师检查后填写破损单，按学校规定赔偿。6贵重仪器，如分光光度计、离心机等，要尽力爱护，使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。 7要节约水电，一经用完随手关闭水门、电门。三、值日生任务1领发本次所用仪器、物品，清点、交还临时用仪器、物品，若有损坏负责追查赔偿。 2管理操作公用仪器，打蒸馏水。 3搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池全干净。 4确保安全：管好仪器、门窗、水电。 5请任课及技术室老师检查工作，认可后方能离开实验室。四、试剂使用规则 1使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。2取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，放回原处。试剂瓶塞、专用吸量管、滴管，不得与试剂瓶分家，以免错用而污染试剂，造成自己或她人实验的失败。未用完的试剂不得倒回瓶内。 3取标准溶液时，应先将标准液倒入干净试管中，再用清洁吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准溶液。 4使用滴管时，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使试剂流入橡皮帽内。 5使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用吸耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 五、安全注意事项 1低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用时应禁明火、远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。 2. 凡属发烟或产生有毒气体的化学实验，均应在通风柜内进行，以免对人体造成危害。 3若发生酸碱灼伤事故，先用大量自来水清洗，酸灼伤者用饱和NaHC03溶液中和，碱灼伤者用饱和H3B03溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S204处理。 4若发生起火事件，根据发生起火性质分别采用砂、水、C02或CCl4灭火器扑灭。 5离开实验室必须关好窗户，切断电源、水源，以确保安全。 六、废弃物处理 1所有固体废弃物如：用过的滤纸、棉花、碎屑沉淀物等必须倾弃于垃圾筒中。 2浓酸必须弃于小钵中，用水稀释后倒入水池中。 3实验完成后之沉淀或混合物含有可提取之贵重药品者不可随意舍弃，应交教师保存。 第一篇 生物化学实验基本操作、基本技术及原理第一章 生物化学实验基本操作【玻璃仪器的洗涤与清洗】 生物化学实验常见各种玻璃仪器，其清洁程度将直接影响实验结果的可靠性。因此，玻璃仪器的清洁不但是实验前后的常规工作，而且是一项重要的基本技术。 玻璃仪器的清洗方法很多，需要根据实验的要求，以及污物性质选用不同的清洁方法。 1新购仪器的清洗 新购仪器表面附着油污和灰尘，特别是附着有可游离的金属离子。因此，新购仪器需要用肥皂水刷洗，流水冲净后，浸于10Na2CO3溶液中煮沸。用流水冲净后，再浸泡于12HCl溶液中过夜。流水洗净酸液，用蒸溜水少量多次冲洗后，干燥备用。 2.使用过的玻璃仪器的清洗 (1)一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如试管、烧杯、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗23次后，倒置于清洁处晾干。 (2)容量分析仪器，如吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，沥干后，浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水和蒸馏水冲洗干净，干燥备用。 (3)比色杯，用毕立即用自来水重复冲洗，如有污物粘附于杯壁，宜用盐酸或适当溶剂清洗。然后用自来水、蒸馏水冲洗干净。切忌用刷子、粗糙的布或滤纸等擦试。洗净后，倒置晾干备用。 【吸量管的种类和使用】 吸量管是生化实验最常见的仪器之一，测定的准确度和吸量管的正确选择和使用有密切关系。 1吸量管的分类 常见的吸量管能够分为三类：（1）奥氏吸量管 供准确量取0.5、1.0、2.0、3.0ml液体所用。此种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。（2）移液管 常见来量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液体，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在盛器内壁停留15秒钟，注意管尖残留液体不要吹出。（3）刻度吸量管 供量取1Oml以下任意体积的溶液。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，吸量管上端标有“吹”字。未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。 图111 三类吸量管简图l、2 刻度吸量管 3奥氏吸量管 4移液管 2吸量管的使用 (1)选用原则 准确量取整数量液体，应选用奥氏吸量管。量取大致积时要用移液管。量取任意体积的液体时，应选用取液量最接近的吸量管。如欲取O.15ml液体，应选用0.2ml的刻度吸量管。同一定量试验中，如欲加同种试剂于不同管中，而且取量不同时，应选择一支与最大取液量接近的刻度吸量管。如各试管应加的试剂量为0.30、0.50、0.70、0.90ml时，应选用一支1.0ml刻度吸量管。(2)吸量管的使用使用吸量管时，用拇指和中指夹近顶端部分，将管的下端插入液体，用吸耳球吸入液体到需要刻度标线上12cm处（插入液面下的部分不可太深，也不可太浅，防止空气突然进入管内，将溶液吸入吸耳球内），用食指封闭上口将已充满液体的吸量管提出液面，把吸量管提到与眼睛同一水平线上，然后小心松开上口，调节液面至需要的刻度处。将吸量管移到另一容器，松开上口，使液体自由流出。最后再根据规定吹出或不吹出尖端的液体。 图l.l.2 放液体时的姿势 3可调式移液器的使用1）可调式移液器的结构 图l.l.3可调式移液器的结构 图l.l.4持移液器的姿势 注：推动按钮内部的活塞分2段行程，第一档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚。 2) 可调式移液器的操作 a调节轮至所需体积值； b套上吸头，旋紧； c垂直持握可调式移液器用大拇指按至第一档； d将吸头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原； e将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于吸头表面的液体(注意：不要接触吸头孔口)； f排放时，重新将大拇指按下，至第一档后，继续按至第二档以排空液体。 注意：移取另一样品时，按卸尖按钮弃掉吸头并更换新吸头。【混匀】 样品和试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地接触，必须借助于外力的机械作用。常见的混匀方法有以下几种： 1.旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转。适用于未盛满液体的试管或小口器皿如锥形瓶。 2.指弹法：一手执试管上端，另一只手轻弹试管下部，使管内溶液作旋涡运动。3.搅动法：使用玻璃棒搅匀，多用于溶解烧杯中的固体。4电磁搅拌混匀 5.混匀器法：将容器置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。 注意：混匀时谨防容器内液体溅出或被污染；严禁用手堵塞管口或瓶口振摇。【保温】 将容器放入恒温水浴箱，调节温度设定钮至所需温度。水浴箱中水分要充分，实验过程中要随时监测温度，并及时调节。【过滤】 用于收集滤液，收集沉淀或洗涤沉淀。在生化实验中如用于收集滤液应选用干滤纸，不应将滤纸先弄湿，湿滤纸将影响滤液的稀释比例。滤纸过滤一般采用平析法(即对折后，再对折)而且使滤纸上缘与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。向漏斗内加液时，要用玻棒引导而且不应倒入过快，勿使液面超过滤纸上缘。较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸。有时以离心沉淀法代替过滤法可达到省时、快捷的目的。【离心沉淀法】 欲使沉淀与母液分开，过滤和离心都能够达到目的，可是当沉淀粘稠，或颗粒小得能够经过滤纸时，则需选用离心法。特别是溶液量小又需定量测定时，离心分离法更具优越性。离心分离是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法，是实验室常规采用的技术。 离心机种类很多，转速少于6000r/min的为低速离心机；转速低于25000r/min的为高速离心机；转速超过30000r/min的为超速离心机。根据离心机的用途不同，还能够将离心机分为分析离心机和制备离心机。其中制备离心技术又分为分级离心技术和密度梯度离心技术。用于生物大分子分离的，还有超速离心技术。本节将简要叙述一般离心机的使用方法(特殊用途的离心机请参阅相关的说明书)。 低速离心机的使用： 1离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，观察是否转动平稳；检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物；离心管与套管是否匹配。 2离心原则 平衡：将一对离心管放入一对套管中，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间滴水至两侧平衡。 对称：将已平衡好的一对套管置于离心机中的对称位置。3离心操作 (1)对称放置配平的一对套管后，盖严离心机盖, 开启电源。(2)调节转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，当离心机转速达到要求时，开始计时。（3）达到离心时间后，缓慢将转速调回零。断开电源，当离心机自然停止后，取出离心管和离心套管。 (4)倒去离心套管内的平衡用水，倒置于干燥处晾干。 4注意事项 （1）离心机的起动、停止都要慢，否则离心管易破碎或液体从离心管中溅出。 （2）离心过程中，若听到特殊响声，应立即停止离心，检查离心管。若离心管已碎，应清除并更换新管；若管未碎，应重新平衡。 第二章 实验样品的制备【血液样品】 1全血 取清洁干燥的试管或其它容器，收集人或动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂的种类能够根据实验的需要进行选择，可是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。常见剂量如下：草酸钾或草酸钠l2mg；柠檬酸钠5mg；氟化钠510mg；肝素0.10.2mg。 抗凝剂宜先配成水溶液，按取血量的需要加于试管或适当容器内，横放，再蒸干水分(肝素不宜超过30)，使抗凝剂在容器内形成薄层，利于血液与抗凝剂的均匀接触。 取得的全血如不立即使用应储于4冰箱之中。 2血浆 抗凝之全血在离心机中离心，使血球下降，如此得到的上清液即为血浆。质量上乘的血浆应为淡黄色。为避免产生溶血，必须采用干燥清洁的采血器具和容器，并尽可能地少振摇。 3血清 收集不加抗凝剂的血液，室温下自然凝固，所析出的草黄色液体，即为血清。制备血清时血凝块收缩析出血清，大约需要3小时。为促使血清尽快析出，必要时能够采用离心的方法缩短分离时间，而且可得到较多的血清。 制备血清同样要防止溶血，因此，应用的器具应当干燥清洁。而且血清析出后宜用干净的玻璃棒轻轻分离血凝块与容器壁的粘连，及时吸出析出的血清。【组织样品】 在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。 可是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必须在冰冷条件下进行，而且尽快完成测定。否则其所含物质的量和生物活性物质的活性都将发生变化。 一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织之后，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。 组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或者加入少量黄砂于乳钵中，研磨至糊状。 组织匀浆：取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。由于匀浆器的杵头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。 常见的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和025molL的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。 组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。第三章 分光光度法 光是由光子所组成，光线就是高速向前运动的光子流，光的本质是一种电磁波，传播过程呈波动性质，具有波长和频率的特征。将电磁波按波长(或频率)顺序排列起来，即得：射线 X射线 紫外线 可见光 红外线 无线电用电磁波人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400760nm，波长范围在200400nm为紫外光区(波长760nm)。可见光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光(复合光)，利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。 一切物质都会对某些波长的光进行吸收，而物质对不同波长的射线，表现为不同的吸收现象，这一性质称为选择性吸收。有色溶液之因此呈现不同颜色，就是由于这种对光的选择性吸收所致。某些无色物质虽对可见光无吸收作用，但也能选择性地吸收在可见光范围外的部分光能，即可吸收特定波长的紫外线或红外线。物质的吸收光谱与它们本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比。故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。吸收光谱的测定可用来检测各种不同的物质。分光光度法的原理 分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。 1Lambert定律 一束平行单色光垂直照射于一均匀物质(溶液)时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。 2Beer定律 当一束单色光经过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比。 31ambert-Beer定律(又称吸收定律) A=KCL A=-1gT A为吸光度(光密度、消光度) C为溶液的浓度 L为溶液的厚度 其中K为常数，又称消光系数(extinction coefficint)，表示物质对光线吸收的本事，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。 4待测样品浓度计算 根据lambert-Beer定律，如果单色光的波长、溶液的性质和溶液的厚度一定时，用一个已知浓度的标准液和一个未知浓度的待测液进行比色分析就能够得出下列运算公式： A标：KC标L = A样：KC样L 由于是同一类物质及相同光径，故 A样A标=KC样LKC标L=C样C标 C样=A样A标C标 式中C样= 待测样品浓度，A样= 待测样品吸光度。 C标= 标准溶液浓度，A标= 标准溶液吸光度。 根据上式可知，对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说，溶液的吸光度和溶液的浓度呈正比。故己知标准溶液的浓度及吸光度按公式可算出测试样品溶液的浓度。 【分光光度计的结构】 分光光度计的种类很多，其基本原理及结构基本相似，一般都包括下列几个部件，如下图所示。 1光源 一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮、稳定、光谱范围较宽和使用寿命长等特点。 分光光度计上常见的光源有钨灯和氢灯(或氘灯)，前者适用于340900nm范围的光源，后者适宜于200360m的紫外光区，为了使发出的光线稳定，光源的供电需要由稳压电源供给。 2单色器 单色器是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯波长的光线，经过此色散系统可根据需要选择一定波长范围的单色光，单色光的波长范围愈狭，仪器的敏感性愈高，测量的结果愈可靠。 3狭缝 狭缝是由一对隔板在光通路上形成的缝隙，经过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要，分光光度计的缝隙大小是可调的。 4吸收池(或称比色杯、比色皿、比色池) 一般由玻璃或石英制成。 在可见光范围内测量时，选用光学玻璃吸收池：在紫外线范围内测量时必须用石英池。 注意保护比色杯的质量是取得良好分析结果的重要条件之一，吸收池上的指纹、油污或壁上的一些沉积物，都会影响其透光性，因此务必注意仔细操作和及时清洗并保持清洁。 5检测系统主要由受光器，和测量器两部分组成，常见的受光器有光电池、真空光电管或光电倍增管等。它们可将接收到的光能转变为电能，并应用高灵敏度放大装置，将弱电流放大，提高敏感度。经过测量所产生的电能，由电流计显示出电流的大小，在仪表上可直接读得A值，T值。较高级的现代仪器，还常附有电子计算机及自动记录仪，可自动描出吸收曲线。第四章 层析法 层析技术是近代生物化学最常见的分离技术之一。层析系统包括两个相，一个称为固定相，另一个称为流动相。当以流动相流过加有样品的固定相时，由于样品各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，受固定相的阻力与流动相的推力的影响不同，因而各组分在固定相与流动相之间的分配也不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99。层析法是分离率、灵敏度(pgfg级)、选择性均高的一种分离方法，特别适合样品含量少，而杂质含量多的复杂生物样品的分析。 固定相能够是固体也能够是液体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体(Support)。同样流动相能够是液体也能够是气体。【分类】 1按层析原理分类 (1)吸附层析(Adsorption Chromatography)固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。 (2)分配层析(Partition Chromatography)固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。 (3)离子交换层析(Ion Exchanger Chromatography)固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 (4)凝胶层析(Gel Chromatography)固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 (5)亲和层析(Affinity Chromatography)根据生物特异性吸附进行分离，固定相只能和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力者结合，而与无结合能力的其它组分分离。 2按操作方式不同分类 (1)纸层析(Paper Chromatography)以滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。 (2)薄层层析(Thin Layer Chromatography)以一定颗粒度的不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。 (3)柱层析(colunm Chromatography)将固定相装柱后，使样品沿一个方向移动，以达到分离目的。3几种层析法【纸层析】 用滤纸作为支持物的层析法，称为纸层析。纸层析结果的好坏除了与选用展开剂的种类、实验中的点样量多少、点样时是否扩散和实验条件是否稳定有关外，还与所用层析滤纸的质量好坏密切相关。对层析用滤纸的要求是：质地均匀、厚薄均一、机械强度好、平整、无折痕、无明显纵向和横向纸纹等。层析常见的滤纸有whatman和国产新华层析滤纸。根据层析快慢及纸厚度可分若干型号。表l-4-1新华层析滤纸的规格和性能 型号 厚度(mm) 性能 备注 l 2 3 4 5 6 0.17 0.16 0.15 0.34 0.32 0.30 快速 中速慢速快速中速慢速 1快速滤纸，因纸质疏松，斑点易扩散，适合于Rf值较大的样品和粘度较大的展开剂 2慢速滤纸，斑点不易扩散，适合于Rf值较小的样品和粘度较小的展开剂，但展开时间较长 3新华2、5号滤纸相当于whatmanI和III号层析滤纸由于纸层析是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力，约能吸收2022的水，其中部分水与纤维素羟基以氢健形式存在，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，因此滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相(展开剂)。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行溶液分配，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。溶质在纸上的移动速度可用迁移率Rf值表示：样品原点到斑点中心的距离Rf= 样品原点到溶剂前沿的距离 能够根据测出的Rf值来判断层析分离的各种物质，当与标准品在同一标准条件下测得Rf值进行对照，即可确定该层析物质。 影响Rf值的因素有很多，除被分离组分的化学结构、样品和溶剂的pH值、层析中温度等外，流动相(展开剂)的极性也是一个重要因素。展开剂极性大，则极性大的物质有较大Rf值，极性小的物质Rf值亦小，反之亦然。常见流动相的极性大小依次排列如下：水甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙脂氯仿乙醚甲苯苯四氯化碳环己烷石油醚层析时，流动相不应吸取滤纸中的水分，否则改变分配平衡，影响Rf值。因此多数采用水饱和的有机溶剂如水饱和的正丁醇，被分离物质的不同，选择的流动相也不同。 纸层析法既可定性又可定量。定量方法一般采用剪洗法和直接比色法两种。剪洗法是将组分在滤纸上显色后，剪下斑点，用适当溶剂洗脱后，用分光光度计法定量测定。直接比色法是用层析扫描仪直接在滤纸上测定斑点大小和颜色深度，绘出曲线并可自动积分，计算结果。 为了提高分辨率，纸层析可用两种不同的展开剂进行双向展层，双向纸层析一般把滤纸裁成长方形或方形，一角点样，先用一种溶剂系统展开，吹干后，转90度，再用第二种溶剂系统进行第二次展开。这样，单向纸层析难以分离清楚的某些物质(Rf值很接近)，经过双向纸层析往往能够获得比较理想的分离效果。【薄层层析】 薄层层析是利用玻璃板、塑料板、铝板、聚酰胺膜等作为固定相的载体，在板上涂一薄层不溶性物质为固定相，再把样品涂铺在薄层的一端，然后用合适的溶剂作为流动相(展开剂)。薄层层析因固定相涂布物质的不同，可分成吸附薄层层析、离子交换薄层层析和分配薄层层析等三种。一般说的薄层层析就是指吸附薄层层析。有关薄层层析的基本原理与Rf的计算与纸层析基本相似。现就薄层层析时应注意的事项简述如下： 1吸附剂的选择 吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常见吸附剂有硅胶、氧化镁、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂，适合分离酸性和中性物质；氧化铝和氧化镁是微碱性吸附剂，适合分离碱性和中性物质；硅藻土和纤维素为中性吸附剂，适合分离中性物质。 2吸附能力 一般用活度来表示吸附剂的吸附能力。吸附能力主要受吸附剂含水量的影响。其由强到弱程度以I，II， III，V 表示。吸附剂活度强时，能吸附极性较小的基团；吸附剂活度弱时，对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的办法，减少吸附水分，从而增强其活度。一般，分离水溶性物质时，因其本身具有较强极性，故吸附剂要弱一些：相反，分离脂溶性物质时，吸附剂活度要强一些。3颗粒大小 无论那一种薄层层析，其吸附剂颗粒的大小和均匀性，是保证每次实验保持Rf值恒定的基础，一般使用吸附剂颗粒直径为无机类 0.070.1mm(150200目)，有机类0.10.2mm(70140目)。颗粒太粗，层析时溶剂推进快，但分离效果差，而颗粒太细，层析时展开太慢，易产生斑点不集中并有拖尾现象。 薄层层析的优点是：设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，可用腐蚀性的显色剂并可在高温下显色。 纸层析和薄层层析均可用于氨基酸、肽、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。【离子交换层析】 离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。作为固定相的离子交换剂，根据其不溶性物质(母体的化学本质)能够分为以下几类： 第一类是在纤维素分子结构上，连接一定的离子交换基团生成的离子交换纤维素。如DEAE-纤维素(二乙基氨乙基纤维素)、羧甲基(CM)纤维素、TEAE-纤维素(三乙基氨乙基纤维素)、GE-纤维素(胍乙基纤维素)等。 第二类以不溶性的人工合成高分子为母体的离子交换树脂。如华东强酸阳42#、强酸732、AmberliteIR100、Dowex 50、AmberliteIRC-50、神胶800等。 第三类是以葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团生成的离子交换葡聚糖凝胶。如DEAE-Sephadex A25、A50，CM-Sephadex C25，SP-Sephadex C25,QAE-SephadexA25、A50等。 以上各类离子交换剂，还可根据其所含酸性或碱性基团的解离能力的强弱，可进一步分成强酸型和弱酸型以及强碱型和弱碱型。 离子交换剂的作用原理如下： 阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。 RS03- H+ Na+= RS03- Na+ + H+ 阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。 RN+ (CH3)30H-+ Cl-=RN+( CH3)3C1- + OH- 流动相中，不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团上以后，能够用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。在实际工作中，可根据被分离物质所带电荷的种类、分离物分子的大小、数量等选用适当类型的离子交换剂。 离子交换层析时应注意以下几点： 1选择合适的离子交换树脂 被分离的物质为无机阳离子或有机碱时，选用阳离子交换树脂；若是无机阴离子或有机酸时，选用阴离子交换树脂。交换树脂颗粒大小：离子交换树脂多为200400目，纤维素离子交换剂为100325目。分离用的树脂一般以直径较小为宜，因粒度小，表面积大，分离效率高。但粒度过小，装柱时太紧密，流速慢，需提高洗脱压力。 2交换剂的处理 离子交换树脂出厂时为干树脂，使用时需用水或溶液浸透使其充分吸水溶胀，然后减压去气泡。倾去浮在溶液中的小颗粒树脂，再用去离子水洗至澄清，使用前用所需的pH和离子强度的缓冲液平衡，纤维素交换剂使用前处理原则基本同上。离子交换树脂和纤维素交换剂，均可再生后重复使用。再生方法为交换树脂使用后，将交换树脂泡入稀酸或稀碱溶液中，一段时间后用蒸馏水洗至中性；或用稀酸、稀碱缓缓流过交换柱。然后再洗至中性。离子交换纤维素使用后用2molL NaOH洗涤，然后用水洗净碱液，再用缓冲液平衡，供下次实验用。 3装柱 一般层析柱选择的原则是柱的高度与直径之比以10：l到20：l为宜。装柱方法一般采用重力沉降法，其关键是交换剂在柱内必须分布均匀，严防脱节和产生气泡，柱中交换剂表面必须平整。4洗脱 一般是根据所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团，从而把吸附物质顶替出来，利用此原则选择各种洗脱液。若分离的是非单一物质，除正确选择洗脱液外，还可采用控制流速和分段收集的方法获得尽可能单一物质。对一些复杂组分的分离，可采用浓度梯度洗脱或pH梯度洗脱。【凝胶层析】 凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶胀成一种柔软富有弹性，不带电荷，不与溶质相互作用的惰性物质，以它作为固定相的层析称为凝胶层析。层析用的凝胶大多为人工合成。当前应用最多的为葡聚糖凝胶(Sephadex)，它是一种次环氧氯丙烷作交联剂交联聚合而成的右旋糖苷珠形聚合物。聚合物具有主体多糖网状结构，其网孔大小与交联度有关，交联度越大，网状结构越致密，网孔的孔径越小，交联度越小，网状结构越疏松，网孔的孔径越大。由于被分离物质的分子大小(直径)和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而最后流出层析柱。可见凝胶层析中的凝胶起着分子筛的作用，因而又称为分子筛层析，或排阻层析。 葡聚糖凝胶(Sephadex)不溶于水，但能吸水膨胀，其吸水量与交联度成反比，在Sephadex后面缀上G-X作为交联度的标记。交联度越小，吸水量越大，X值越大。实际上X值约为该胶粒吸水量的10倍。例如：Sephadex G-50和G-100，吸水量分别为5ml水g凝胶与10mlg凝胶。另外交联度大，机械强度大，较能容忍较高压力，易采用高流速；而交联度小的如SephadexG-150，G-200，则机械强度小，易被压缩。使用时流速需慢些，一般每分钟流速不大于2.0ml。另外尚有以N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂将丙烯酰胺聚合而成的聚丙烯酰胺凝胶，其商品名为生物胶P(Bio-Gel P)；琼脂糖凝胶是由D-乳糖和3，6无水一L乳糖残基组成的多聚糖，市售有Bio-Gel A和Sepharose；交联琼脂糖(Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B及Sepharose CL-6B)等。各种凝胶由于交联剂的种类和比例不同，因而同一类凝胶可分成若干种类，分离大分子物质的性能也不一样。使用时必须根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的选择不同类型的凝胶。【亲和层析】 亲和层析是以能与生物高分子进行特异结合的配基作为固相对混合物中某一生物高分子进行一次性分离纯化的层析技术。 生物高分子具有能与其结构相对应的专一分子进行可逆性结合的特性。如：酶与底物、产物、辅酶、抑制剂和变构调节剂结合，激素与受体结合，抗原与相正确抗体结合，RNA与互补的DNA结合等。把作为配基(载体)的专一分子(如酶的底物、辅酶，抗原的互补抗体)以共价健连接到不溶性载体(如纤维素、葡聚糖凝胶)上，使之固相化，然后将固相化的载体装入层析柱，作为层析的固定相，把含有一种或数种生物高分子(如蛋白质)混合液加到柱上，这时混合物中只能与不溶性配基具有高度亲和性的蛋白质被吸留，其它不能与配基结合的蛋白质则不受阻碍地直接从柱中流出。再用缓冲溶液洗脱沾附在配基表面的非亲和吸附物，改变洗脱液，把特异吸附的蛋白质从不溶性配基上解离和洗脱下来。