冰淇淋菌落总数实时荧光光电快速检测方法的建立与初步应用.pdf

32 食品安全导刊 2013年11月冰淇淋菌落总数实时荧光光电快速检测方法的建立与初步应用随着人们生活水平的不断提高，微生物对食品的污染也相应地成为食品安全中备受关注的突出问题。在食品生产、加工、包装、储存、运输和销售的各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染或食物中毒。目前传统的微生物检测方法主要是形态检查和生化方法，虽然其灵敏度和特异性较高，但所涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，仍然是劳动密集型工作。所以准确、省时、省力的快速微生物检测方法已是社会的迫切需要。相比传统微生物培养，自动化的微生物检测系统具有操作简便、快速、无需配套的专业实验室和增加过多专业人员等优点，因此非常适合企业自检使用。这其中具有代表性的就是美国BioLumix实时快速微生物荧光光电检测系统。该系统将最新的荧光光电技术、染色技术、CO2传感技术和特异性的培养技术结合在一起检测生物体的代谢过程,使之能够同步检测颜色和光子的变化。目标微生物在特定培养基中的生长和代谢可通过感光试剂（色彩和荧光染色）检测。当代谢过程发生时，试剂的光谱模式会发生改变；光传感器检测到这些变化后以预先设定好的时间间隔进行监控并报告检测结果。菌量越高检测时间越短。冰淇淋是广受消费者尤其是青少年喜爱的即食冷冻食品，微生物指标的准确快速检测和严格控制具有非常重要的意义。然而冷冻食品中的微生物有其自身的特点，微生物在冷冻条件下处于休眠状态，并逐渐适应了超低温的环境。在检测时既要对这些受伤的细菌进行修复，又要使其在常规的培养温度下和传统的48小时内充分生长并准确计数，就不是一件容易的事情。二氧化碳是所有微生物代谢的产物。为了建立一个准确而快速的冰淇淋总菌检测方法，故采用以二氧化碳传感和实时荧光光电检测为主要技术的BioLumix检测系统来完成本次实验。本实验采用BioLumix系统中的曲线法来定量检测冰淇淋中的菌落总数。即用自然样本和增菌处理过的冰淇淋样品制作一条菌落总数校准曲线，然后在BioLumix系统中使用这条校准曲线直接进行冰淇淋样品中菌落总数的定量检测，同时与国标检测方法的结果进行对比，以此确定BioLumix系统对冰淇淋中的菌落总数检测的适用性。实验仪器与材料BioLumix实时快速微生物荧光光电检测系统；国内某厂家提供的各种口味的冰淇淋。曲线制作方法1.样品的处理与制备取含巧克力与水果成分的奶料雪糕1 10稀释后121高压灭菌15分钟，冷却后备用,编号AX。取相同雪糕25g，与225mL、0.85%生理盐水混合均匀，编号A1。取A1 5mL,与45mL AX混合均匀，编号A2。将同一批次的巧克力水果口味的雪糕进行增菌和冷冻，然后取25g与225mL、0.85%生理盐水混合均匀，编号AZ1。2.样品的稀释取AZ1 5mL,与45mL AX混合均匀，编号AZ2；取AZ2 5mL,与45mL AX混合均匀，编号AZ3；依此进行6个梯度的10倍稀释。3.检测将上述A1、A2及AZ1AZ7，各取1mL分别加入1支BioLumix菌落总数检测管 李芳 原铨 上海美凯纯生物科技有限公司SpecialcialCIFSQ 2013专题Nov 2013 CHINA FOOD SAFETY 33中，混合均匀，放入BioLumix仪器中进行检测，以得到每个样品的BioLumix系统的DT(检测时间)。同时，将A1、A2及AZ1AZ7选择合适的稀释度按GB 4789.2-2010做平板培养，以得到每个样品的菌落总数值。4.重复实验为了使得到的校准曲线更准确，准备多个样品，重复上述步骤，以得到至少30组数据，数据组越多，校准曲线越准确。5.校准曲线的建立将上述多个样品的BioLumix系统的DT（检测时间）和对应的平板菌落总数值输入到BioLumix软件界面中，经过修整后，得到一条以DT(检测时间)为横轴，以相应的菌落总数值(CFUmL)的对数LogCFU作为纵坐标的校准曲线。6.校准曲线的验证取同一厂家生产的多个品种和批次的冰淇淋各25g与225mL、0.85%的生理盐水混合后各取1mL分别加入BioLumix系统菌落总数检测管中上机检测，同时对同一样品按GB 4789.2-2010做平板培养。将得到DT值，带入校准方程中，得到BioLumix系统报出的CFU值，与对应的平板菌落总数值对比。结果根据实验数据得到的校准曲线和校准曲线方程如表1所示：LogCFU=6.057-0.468*DT，相关系数R=-0.94。国家规定的含乳蛋白类的冷冻饮品菌落总数25000CFU/mL，本次实验得到的曲线最高可检测到105的菌，其检测范围已覆盖到国家规定的菌含量。本次实验所使用的同一厂家生产的CIFSQ 2013表 1 冰淇淋中菌落总数验证数据样品编号样品名称检测时间DT/h校准曲线 换算值 CFU/g平板菌落 总数值 CFU/g对比结果1甜筒雪糕8.01200550偏离2双莓酸奶味雪糕10.1290250相符3巧克力脆饼雪糕11.6100110相符4巧克力水果雪糕10.1290100相符5升级版玉米香雪糕10.7190210相符6蛋奶巧克力雪糕9.7380220相符7牧场牛牛雪糕9.5430370相符8大布丁奶油味雪糕12.94035相符9红枣牛奶雪糕11.5110140相符10牧场奶砖雪糕10.7190140相符11牛奶蜜豆雪糕9.7380290相符12牛奶蜜豆雪糕13.33240相符13牛奶巧克力雪糕12.33030相符14牛奶巧克力雪糕13.14050相符15酸奶布丁雪糕15.57 10相符16大奶糕雪糕12.46445相符17巧克力水果雪糕9.2530510相符18升级玉米香雪糕11.610095相符19巧克力水果雪糕8.8710550相符20巧克力水果雪糕9.6410530相符21巧克力水果雪糕9620880相符22牛奶巧克力雪糕14.31685相符23巧克力脆饼雪糕10.4240160相符24巧克力脆饼雪糕9.7380290相符25芒果哈密瓜雪糕11.2140160相符26蜜瓜仙子雪糕12.17085相符27火炬苦咖啡冰淇淋12.36045相符28牛奶蜜豆雪糕10.6200340相符29牧场奶砖雪糕12.17055相符30三色香雪糕11.4120220相符34 食品安全导刊 2013年11月冰淇淋，其产品的菌含量一般都控制在1000CFU/g以下，因而在该曲线范围内都可以检测，软件也可以自动对超过企业内控指标上限的高污染样本发出预警。校准曲线验证结果如图1所示。由于微生物的特性，任何两个检测的结果都不可能完全相等。因此，凡是BioLumix系统的菌落总数值与平板计数在同一个数量级上或者在0.5LogCFU之内，都可判定为两者检测结果相符。从表1中可以看出，在1000CFU/g以内的BioLumix系统结果与平板结果基本一致。讨论采用所建立的校准曲线对30例不同种类的冰淇凌产品进行了验证，结果表明在1000CFU/g以内的样品中有29例BioLumix系统快速检测结果与国标平板结果基本一致。1例样品的两种检测结果出现了偏离，即BioLumix系统检测结果（1200cfu/g）高于平板结果550 cfu/g）。由于这例出现偏离的结果是BioLumix系统高于平板计数，因而不会出现BioLumix系统漏检超标样品的情况；实际应用中可通过复检进行确认。此外，由于本次实验所使用的同一厂家生产的冰淇淋，其产品的菌含量一般都控制在1000CFU/g以下，无法得到自然条件下的高菌含量样品，因此未能对所建立的菌落总数校准曲线的高点部分进行自然样本（非加标）验证，但这并不影响该校准曲线的使用。因为生产厂家成品的菌含量通常会控制在一个内控的范围内，一旦产品的菌含量突然增高，这条曲线上得出的数值也会相应变大，与国标平板培养结果变化方向是一致的。对于数值的增高，系统软件会自动发出预警，提醒检测人员注意。结论本实验通过对冷冻饮品冰淇淋中的菌落总数采用BioLumix系统和国标检测方法同步进行检测。初步建立了一条以DT（检测时间）为横坐标，以对应的菌 落总数值的对数LogCFU为纵坐标的校准曲线。并且用同类 正常样品对这条曲线 进行了验证，两种方法的检测结果基本一致。传 统 方法检测产品的菌落总数要经过48小时才能出检测结果，这样势必会影响产品投放到市场的速度，对于易腐食品，则缩短了产品的货架期；对于原料检验来说，则增加了原料压库的成本，降低了企业的资金周转率。而使用BioLumix系统检测产品中的菌落总数，数小时即可得到检测结果，大大节省了检测时间。同时还具有操作简单、节省人工、减少检测环节污染引起的假阳性、自动保存检测结果、提供风险追溯等优势，因而具有非常高的投入产出比。相比于市场上出售的一些比色法、PH指示剂法的检测瓶或者压缩型的干燥微生物测试片，我们在实验中也发现，这些产品容易受到产品颜色、PH值和产品性状、纸片中营养成分不足等的干扰和影响，使检测结果缓慢或不准确，因而不能够提供真正意义上的快速准确的检测。而Biolumix系统可以有效地克服以往这些检测方法的缺陷，使检测结果更符合真实的微生物含量，速度更快，且不受样本颜色和PH的影响，操作过程中无需调节样本的PH。BioLumix系统作为一种新型的微生物快速检测系统，适用于冰淇淋中菌落总数的检测。图 1 校准曲线和校准曲线方程SpecialcialCIFSQ 2013专题