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404 2013,Vol.34,No.09 食品科学 专题论述宏基因组技术及其在酶制剂中的应用于 雷，于 丽，张 薇，陆丽丽(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118)摘 要：自然环境中有超过99%的微生物是不可培养的。使用宏基因组技术，人们首次实现了对不可培养微生物的开发，这为探索和挖掘新的酶制剂和活性小分子提供了更为有力的技术手段。本文重点介绍宏基因组技术最新的研究进展及其在新酶开发中的成功应用，以期利用宏基因组技术推进新酶开发，为其在食品工业中的应用提供有效途径。关键词：宏基因组；宏基因文库；酶制剂；富集技术；DNA提取Research Progress of Metagenomic Technology and Its Application in Enzyme PreparationYU Lei，YU Li，ZHANG Wei，LU Li-li(College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)Abstract：More than 99%of microbes in natural environment are uncultivable.These uncultivable microorganisms have been exploited for the first time by using metagenomic technology,especially as a more powerful technique for the exploration and mining of novel enzymes and active small molecules.In this paper,the current research advances of metagenomic technology and successful applications in the development of new enzymes have been summarized,which will accelerate the development of new enzymes through metagenomic technology and provide an effective strategy for its application in the food industry.Key words：metagenomic technology；macro-gene library；enzyme；enrichment technology；DNA extraction中图分类号：Q819 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)09-0404-04doi:10.7506/spkx1002-6630-201309077收稿日期：2012-05-06作者简介：于雷(1973)，男，副教授，博士，研究方向为食品科学与生物工程。E-mail：目前，酶法催化因其具有可常温反应、反应速度快、催化作用专一、能够在水相中催化等优点，已经逐渐成为国际绿色化学发展的重要趋势之一。酶制剂作为生物催化剂广泛应用在化工、医药和能源等产品的开发中1。酶催化剂与有机催化剂相比具有较强的催化能力，它能够把一系列复杂的分子作为底物且反应速率是非酶催化反应速率的几十甚至几百倍。因此，人们构建出越来越多的酶分子催化工艺，以替代传统高能耗和高污染的化学催化工艺，满足人们对节能环保的需求。“Metagenome”是由Handelsman等2于1998年提出的一个新名词，其定义为特定生物环境中全部微小生物遗传物质的总和，主要包括细菌和真菌。自然界中的微生物是生物催化剂的一个非常重要的来源，人们利用传统的方法从环境样本中分离新型酶主要是建立在纯培养的基础上，据估计通过纯培养方法开发的环境微生物只占总量的0.1%1%3。而生物环境中有多达99%以上的微生物是不可培养的。宏基因组是直接从环境样本中提取总的DNA，利用合适的载体克隆至宿主细胞构建宏基因文库，从中筛选新的目的基因及活性物质。此外，研究者们从一些具有极端pH值、极端温度、低水分活度、高渗透性、高光照等极端条件的环境中分离出来具有了新型的框架及适应此栖息环境的特殊催化性能的酶。利用宏基因组技术对环境中DNA进行分离、归档和分析，以便更好地开发利用生物的多样性，识别并了解它们的基因序列、蛋白质编码序列甚至重建其代谢途径。宏基因组的研究使人们摆脱了微生物不可培养的限制，揭示出更多新的生物学规律，同时也为人们挖掘微生物来源的新酶及活性小分子，提供更为强大的技术手段。本文通过对宏基因组技术的综述，以期其在酶制剂研发方面得到更为广泛的应用。同时利用宏基因组技术开发新酶为食品新产品研发奠定了基础，为食品工业化生产开辟了一条新的途径，必将推动食品行业的蓬勃发展。1 宏基因组学概述目前人们使用宏基因组技术手段，主要集中在两方向的研究：一是增强人们对生物多样性和环境微生物相互关系的认识；二是挖掘出新的酶(蛋白)大分子和小分子活性物质4。当今人们使用的大多数酶是从微生物细胞中提取的。除真核生物和单细胞酵母外，原核生物是酶蛋专题论述 食品科学 2013,Vol.34,No.09 405白的主要来源。原核生物(细菌和古生菌)是地球上出现最早和数量最多的生命形态，经历了漫长的演变后为适应恶劣的环境从而具有了很强的适应特性，从中可以得到许多具有特殊催化功能的生物催化剂。但由于大多数原核生物不能够被培养或暂时还没有找到合适的培养底物从而使对其的开发利用受到了限制。宏基因组方法避免了一些微生物培养条件的限制，对不可培养微生物的基因进行提取、筛选与表达，不断扩大自然界中基因样本的数据空间，从中源源不断地寻找出低同源序列的蛋白质，为新型生物催化剂的开发及筛选提供了一个广大的资源库。1.1 宏基因组DNA提取技术宏基因组DNA提取既要尽可能地大量提取样本的基因组，又要保持片段的完整性和纯度5。宏基因组DNA的提取方法主要有两种：一种是原位提取法，该方法操作简单所获得的DNA较完整，并能很好地代表特定生物群落的多样性6。但此方法常会出现细胞裂解不完全或由于机械剪切力较强，使DNA片段过小(一般为15kb)等问题。另一种是异位提取法，是利用物理方法将微生物从环境样本中分离出来，再按纯培养细胞的处理方法裂解微生物细胞提取DNA7。该方法获得的DNA杂质少，DNA片段具有很好完整性(20500kb)。但此方法不易提取一些细胞壁较厚的微生物DNA，并且DNA产率只是原位提取法的1%10%8。对于酶主要来源的土壤宏基因库来说，由于微生物与土壤粒紧密结合及腐植酸等抑制性物质的存在，很难从自然界中获得高分子质量的eDNA。为此人们采用乙醇沉淀法去除土壤粒及腐植酸的干扰，使DNA析出从而得到纯化的宏基因组DNA9。1.2 宏基因组富集技术全细胞的富集培养是利用适合的选择培养基进行筛选，但由于优势菌群的快速生长会竞争有限的营养，进而导致少数的“稀有”菌群的丢失。对此，人们采用先在严格条件下短时间处理，后改为较温和的处理条件，在一定程度上可以克服这一局限性8。稳定同位素探针(stable-isotope probing，SIP)利用13C-DNA检测到的高活性生物群落较小，但被标志的DNA数量较少，利用标准的探针不易被检测到。因此，贾仲军10使用高灵敏的PCR技术，有效地检测到大量在密度梯度离心中看不见的被标记的DNA片段。同时，分子指纹图谱已经被用于判定不同浮力密度中13C-DNA的富集程度，从而获得不同浮力密度DNA11。抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)是通过一次差减杂交使低丰度的序列(mRNA)得以高于1000倍的富集，从而有效地选择扩增目标序列并抑制非目标序列的扩增12。RT-RNA是通过减少单链核苷酸的降解，达到获取完整DNA的方法。由于从环境样本中直接提取的稀有微生物的相关DNA只占总DNA的较少比例，这会导致在后续的PCR操作中，优势微生物目标基因偏嗜性扩增的出现。可以通过微生物均一化的方法来解决这一问题，即在氯化铯梯度离心时存入嵌入剂，如双苯甲亚胺13。此外，稀有物种的DNA与大量的单链DNA相比产生双链核酸的速度快。因此使变性断裂的DNA片段在严格条件下重新退火，可以从双链核酸中分出单链核酸从而使稀有微生物的基因序列得以富集14。1.3 宏基因组文库构建常用的载体有质粒(plasmid)、细菌人工染色载体(BAC)、柯斯黏粒(Cosmid)、福斯黏粒(Fosmid)等15。质粒载体插入片段较小(10kb)而大片段DNA可以采用克隆效率高的Cosmid(3545kb)、BAC(200kb)等载体16。同时由于外源基因的表达受宿主细胞的遗传类型、细胞基质、细胞的生理状态及初级代谢产物的影响，人们利用穿梭载体扩大宿主的范围以便于促进和提高外源基因的表达17。对于质粒型小插入片段的异源表达，应用双向质粒表达载体可以明显提高质粒型小文库中DNA的表达水平，进而提高目标基因产物筛选的命中效率18。另外，对于原位裂解方式获得的eDNA片段，为避免对其携带基因的再次破坏，末端补平或T-A连接的方式替代使用限制性内切酶方法可以提高宏基因组文库的库容19。大肠杆菌由于生长迅速、遗传背景清晰并且遗传操作容易成为克隆外源基因的首选宿主。但是要使异源DNA插入片段成功地转录，要求宿主必须能够识别内在的启动子。而不良的表达会导致蛋白质错误的折叠或不溶。大肠杆菌因具有很少氨基酸的密码子进而导致氨基酸不能正确排列成肽链或者被截断。为此人们使用了噬菌体载体使具有特定活性的酶能够在噬菌体菌苔上直接进行筛选20，或利用穿梭载体替代目标基因在宿主表达的DNA环境21。1.4 宏基因组筛选序列驱动的筛选方法(sequence-driven screening)需要根据已知基因或基因表达产物的保守序列设计探针和引物。这一要求导致许多新型基因不易被发现，甚至使2个共同进化的功能相似的基因也很难用“家族特异性”引物区分开来。由于对序列信息的依赖基因测序技术成为了序列驱动筛选的关键技术。当代最新的测序方法是由Pacific Biosciences公司推出的单分子实时DNA测序。第三代测序技术实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度及自身的延续性，1s可以测序超过10个碱基，酶法测序速度是化学法测序的2万倍，同时它的精度非常高，达到99.9999%22。而序列驱动的筛选方法一般只能获取功能基因的片段得不到基因的全部序列23。目前，人们利用406 2013,Vol.34,No.09 食品科学 专题论述基因步移法(gene walking)对目的片段进行扩增，具体做法是利用扩增子作为标记探针去识别传统宏基因组文库中假定基因或利用PCR技术恢复基因上游或下游空白序列从而得到基因的全部序列18，生秀杰等24利用基因步移法成功克隆出小鼠Doc-1R基因组序列。功能筛选(function-driven screening)不依赖基因序列信息，筛选到的基因与数据库中已知的基因往往具有较低的同源度，适用于大片段DNA文库筛选。功能筛选的方法有两种：一种是在选择培养基上表型特征进行筛选。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体，在选择性条件下依据功能互补生长的特性进行的25此方法往往需要目的基因在宿主内能够成功地表达并产生酶蛋白。但在筛选时细胞内潜脂类酶的活性能够降低筛选的灵敏性，从而降低筛选的产率。已经证实使用细胞裂解剂能使酶分子从细胞内释放出来并成功表达从而保持其本体构象26。底物诱导基因表达法(SIGEX)是利用相关底物诱导基因编码催化活性基因表达为基础的筛选方法。该方法使用一种gfp操纵子捕获载体，载体基因下游具有一个报告基因插入的克隆位点。插入基因表达时可以从报告基因衍生的信号被频繁地识别出来，并在液体培养基中通过荧光激活细胞分离器(FACS)筛选阳性克隆。这种方法为高通量筛选提供了保障，但FACS对进样设备的要求很高，同时其目的基因的结构性和适应性也十分敏感27。2 宏基因组技术在新酶开发中的应用利用宏观基因组技术开发的新型酶蛋白大多具有新的序列，显示了与已知的基因产品的非相似性，进而形成近亲关系的深枝谱系。Jaeger等28利用大肠杆菌为宿主从8个蛋白质家族中筛选到41个编码新型蛋白质的基因，包括二氢叶酸还原酶及转运蛋白等。其中有些来自于同一家族的蛋白质具有不同的抗性序列，这些抗生素耐药性蛋白序列揭示了不同变种所具有的蛋白功能。而这一系列新酶有效地推动了医药行业的发展。此外，多功能酶也作为重要的生物催化剂广泛应用于食品、化学和生物燃料行业5。诸如此类的酶有从沿海海水宏基因组中寻找到的几丁质酶29、土壤宏基因组中的乳酸解聚酶30、牛瘤胃内容物宏基因组中的-葡萄糖苷酶等31。目前利用宏基因组技术开发酶的数量正在成指数级增长，这充分表明该技术对酶基因的筛选及修饰具有很高的使用价值32。Ferrer等33在深海高盐度环境中发现了5种酯酶，有2种与已知酯酶有显著同源性。其结合了3个催化活性中心直接调节水解活性，是一种适应三级到四级结构之间的催化三联体。同时建立了奶牛瘤胃宏基因文库，利用噬菌体作为载体进行活性筛选。证实有22种克隆具有明显的水解活性(12个酯酶、9个内切-1,4葡聚糖酶及纤维糊精酶)，其中36%具有完全新的序列或与已知酯水解酶类及糖基水解酶类低同源性的深支亲缘谱系34。这些酯酶能够有效地水解丙酮缩甘油酸产生手性结构。并且其具有很强的催化水解脂肪、油及一系列羧基脂的能力，在食品工业被用在增加食品的风味、生产风味添加剂、去除污染物以及脂质废物合成结构性甘油三酯，同时其能够使白酒更纯香、食醋更具风味35。宏基因组在食品工业中开发的另外一组较有吸引力的酶是碳水化合物水解酶，如淀粉酶类、葡糖淀粉酶、纤维素酶和几丁质酶等。Brennan等36从白蚁的肠道和鳞翅类动物的嘴中分离微生物的DNA建立基因文库，从中筛选到了木聚糖酶，该酶能催化水解各种与-1,4-相关的低聚木糖及高分子底物，并产生独特的水解产物。在酿酒过程中其能够提高酒精产率、澄清酒液，参与面包的制作及贮藏，在果汁制作中对果蔬细胞壁的去除及对产率的提高发挥着重要作用。磷酸吡哆醛作为VB6的主体药物也被人们不断加以重视。Tirawongsaroj等37从泰国温泉宏基因文库中利用功能筛选方法，找到了具有patatin基因的耐高温脂肪水解酶磷酸吡哆醛。其在pH79，5075范围内展现了较大的活性，且在70时活性最高并可以保持稳定至少120min。宏基因组技术作为新酶开发有利的工具，其开发的酶的数量正在稳定上升并且很快将超过利用传统方法分离的酶。宏基因组技术分离的典型的酶还有-葡萄糖苷酶、脂肪酶、多糖修饰酶(包括纤维素、-淀粉酶、木聚糖酶、1,4-葡聚糖分支酶和果胶裂解酶)、蛋白酶、氧化还原酶、脱氢酶和参与维生素生物合成的酶等38。Duan等39从水牛瘤胃宏基因文库中筛选到13个重组纤维素酶的克隆体。其中有2个克隆体具有降解多糖的基因，并且这些酶在较宽的pH值范围内具有很好的活性。因此，在酒精生产过程中添加纤维素酶可以增加原料的利用率，提高酒精的质量。此外，-葡萄糖苷酶能够将水果、蔬菜及茶中的风味前体物质水解为浓郁的天然香气物质；在酿酒及果汁加工过程中能增加风味物质，使杏仁、青梅果等食品脱苦。所以-葡萄糖苷酶被广泛应用于饮料加工行业。郑艳等40利用毕赤酵母作为宿主菌通过序列筛选的方法使疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶得到了高效的表达。姜智贤等41利用这种酶进行酶促酯交换反应合成代可可脂。这种代可可脂具有与进口代可可脂相同的化学性质，口感与天然可可脂几乎没有差别，并且降低了反式脂肪酸的含量。多糖降解酶能够降解多糖的糖苷键，使新形成的非还原端形成双键。在食品加工过程中多糖降解酶被用于分析多糖结构，改善多糖物理学性质。这些酶在食品工业中为新产品的研发及生产提供了基础，为食品行业的蓬勃发展提供了可能。专题论述 食品科学 2013,Vol.34,No.09 4073 结 语环境微生物总体是一个巨大的基因资源库，人们利用现有技术仅仅能够对其中一小部分进行探索，而宏基因组技术则可揭示环境中生物的多样性及潜在生物催化剂。宏基因组技术跨越了传统依靠微生物培养进行开发和探索的限制，直接从宏基因文库中对DNA进行克隆和筛选，使不可培养微生物的开发成为了可能。现已利用宏基因组技术从文库中开发出许多新型的酶制剂。这些酶制剂表现出了特有的催化性质，能够被广泛地应用于食品工业、医药业、环境治理等领域。虽然宏基基因组技术已经取得令人瞩目的成绩，但作为一种新兴的技术手段，仍需科研工作者对其进行不懈地深入发展和广泛应用，使其能够更为有效地用于探索新的微生物资源。参考文献：1 OH H J,CHO K W,JUNG I S.Expanding functional spaces of enzymes by utilizing whole genome treasure for library constructionJ.J Mol Cat al B:Enzymatic,2003,26(3):241-250.2 HANDELSNAN J,RONDON M R,BRADY S F,et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new frontier for natural productsJ.Chem Biol,1998,5:245-249.3 TORSVIK V,OVREAS L.Microbial diversity and function in soil:from genes to ecosystemsJ.Micobil,2002,5(3):240-245.4 张慧文,张倩茹,周启星,等.分子微生物生态学及其研究进展J.应用生态学报,2003,12(2):286-292.5 黄循柳,黄仕杰,郭丽琼,等.宏基因组学研究进展J.微生物学通报,2009(7):1058-1066.6 WECHSLER P,WILLIAM J,ROBERTSON A,et al.A rapid cost-effective procedure for the extraction of microbial DNA 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