低温贮藏对桃果实冷害和能量水平的影响.pdf

第 28 卷第 4 期农 业 工 程 学 报Vol.28No.42012 年2 月Transactions of the CSAEFeb.2012275低温贮藏对桃果实冷害和能量水平的影响陈京京，金 鹏，李会会，蔡玉婷，赵颖颖，郑永华（南京农业大学食品科技学院，南京 210095）摘要：为探索桃果实低温贮藏时冷害发生与能量水平的关系，该研究将桃果实分别置于 0、5、10下贮藏，定期测定果实褐变指数、硬度和出汁率等冷害指标以及 H+-ATPase、Ca2+-ATPase、琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（CCO）等线粒体呼吸代谢相关酶活性及能量相关物质三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量和能荷变化。结果表明，桃果实在不同贮藏温度下冷害发生程度不同，5贮藏的桃果实褐变指数最高，冷害最严重，0贮藏次之，10贮藏无冷害发生。同时发现 5贮藏果实的 ATP 和 ADP 含量、能荷水平、H+-ATPase、SDH 和 CCO 活性最低。这些结果表明，桃果实冷害发生可能与能量供应不足有关。关键词：冷藏，酶，品质控制，能量水平，桃果实，低温工程，冷害doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.04.046中图分类号：TS255.3文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-04-0275-07陈京京，金鹏，李会会，等.低温贮藏对桃果实冷害和能量水平的影响J.农业工程学报，2012，28(4)：275281.Chen Jingjing,Jin Peng,Li Huihui,et al.Effects of low temperature storage on chilling injury and energy status in peach fruitJ.Transactions of the CSAE,2012,28(4):275281.(in Chinese with English abstract)0引言桃果实芳香诱人，味美多汁，深受消费者喜爱。但桃果实成熟于高温多雨夏季，采后后熟衰老迅速，极易腐烂变质。低温可抑制果实呼吸作用及内源乙烯的产生，有利于桃的贮藏。但桃属于冷敏性果实，在低于 10贮藏 23 周后，即出现冷害症状，主要表现为果肉褐变、木质化或絮状败坏、果汁减少、不能正常后熟和丧失风味等，从而限制果实的贮藏期。应用气调贮藏、低温预贮和外源乙烯处理等保鲜技术均可延缓桃果实冷害发生，延长贮藏寿命1-3。一般果实在冷害临界温度以下，冷藏温度越低，冷害发生越严重。但 Crisosto 等4发现桃果实在较高温度冷藏时冷害发生更严重，贮藏于25下的桃果实 12 周内即表现出冷害症状，而在 0贮藏时 3 周后才出现冷害症状，产生这种现象的原因仍不清楚。线粒体是呼吸作用和能量物质三磷酸腺苷（ATP）产生的重要场所，为一切生命活动提供能量。H+-ATPase、Ca2+-ATPase、琥珀酸脱氢酶（succinic dehydrogenase,SDH）和细胞色素氧化酶（cytochrome C oxidase，CCO）是线粒体呼吸代谢关键酶，这些酶活性的下降会导致线粒体结构和功能的破坏，影响能量合成，从而导致细胞能量供应不足5。近年来的研究发现，园艺作物采后衰老收稿日期：2011-06-29修订日期：2011-08-19基金项目：国家自然科学基金（31000824），国家大学生科技创新项目（101030724），南京农业大学 SRT 计划项目（1008A16）作者简介：陈京京（1986），女，江苏宿迁人，主要从事农产品贮藏与加工研究。南京南京农业大学食品科技学院，210095。通信作者：郑永华（1963），男，浙江诸暨人，博士，教授，博士生导师，从事农产品贮藏加工研究。南京南京农业大学食品科技学院，210095。Email：和褐变的发生可能与能量合成下降而造成的细胞能量亏缺有关6。如 Su 等7发现龙眼果皮褐变可能是能量亏缺造成的；Saquet 等8报道果实组织能量物质 ATP 在维持细胞膜的完整性中起重要作用，ATP 含量的下降是引起梨果实果心褐变的重要原因。采用外源 ATP 处理，则可提高果蔬组织能量水平，从而减轻组织褐变。如 Song等9发现荔枝果实采后用 1.0 mmol/L ATP 浸泡处理，可有效抑制荔枝果实表皮膜透性的增加，延缓褐变的发生。但有关果蔬冷害发生与能量水平之间的关系尚未见报道。为此，本文研究比较了不同贮藏温度下桃果实冷害发生程度和能量代谢的变化，以探索果实冷害发生与能量水平的关系，进一步阐明果实冷害发生的机理，为桃果实适宜贮藏温度条件的确定提供依据。1材料与方法1.1材料及处理试材为霞晖 5 号水蜜桃Prumus persica(L.)Batschcv.Xiahui5，采自江苏省农科院果园。果实于八成熟时采收并在 1 h 内运回实验室，选择大小基本一致，无机械损伤，无病虫害的果实分别于 0、5、10下贮藏。各温度贮藏果实均用 0.01 mm 聚乙烯保鲜袋包装，每袋 15 个果实，袋口用橡皮筋绕两圈以透气保湿。10贮藏每隔3 d取样，0和 5贮藏每隔 5 d 取样，并置于 20货架期3 d，每次取样 3 袋果实，然后测定以下各项指标。1.2测定方法1.2.1果实褐变指数的测定取 15 个果实，沿缝合线纵切，按褐变发生程度分为5 个等级，即 0 级，无褐变；1 级，褐变面积小于 5%；2级，褐变面积为 5%25%；3 级，褐变面积为 25%50%；4 级，褐变面积大于 50%。按照下面公式计算褐变指数：农业工程学报2012 年276褐变指数=(褐变级别该级别中果实个数)/(4测定果实个数)。1.2.2果肉硬度测定用 TA-XT2i 质构仪测定果实硬度。探头（SMSP/6）直径为 5 mm，下压距离为 5 mm，下压速度为 1 mm/s，取最大值，重复 10 次，取平均值。1.2.3果肉出汁率测定称取 10 块左右的果肉块（直径 6 mm，厚 6 mm）装入垫有吸水棉的离心管中，1 500 g 离心 10 min，以果实离心后的失重率作为果实的出汁率。1.2.4相对电导率的测定用 DDS-IIA 型电导仪测定外果层果肉圆片浸提液的电导值，煮沸后再测定浸提液的电导值，以煮沸前后的电导比值得相对电导率来表示细胞膜渗透率。1.2.5丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定参照李丽萍等方法10进行测定，结果以 nmol/g 表示。1.2.6三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸腺苷(AMP)和能荷(EC)的测定桃果肉中 ATP、ADP 和 AMP 的提取和含量的测定参照 Liu 等方法11。称取 2g 果肉用液氮研磨后加入 6 mL0.6 mol/L高氯酸冰浴提取，在4下16 000 g离心15 min，迅速取 3 mL 的上清液用 KOH 调至 pH 值为 6.56.8，定容到 4 mL，并过 0.45 m 滤膜。用 HPLC 法测定 ATP、ADP 和 AMP 的含量，所用仪器为 Agilent HPLC Series1200（安捷伦科技有限公司）。色谱条件为 Kromasil C18反相柱（ODS，250 4.6 mm），检测波长 254 nm，流动相为甲醇（A）和 0.1 mol/L pH 值为 7.0 磷酸钾缓冲液（B）。线性梯度洗脱，时间为 10 min，延迟 2 min，流速1.0 mL/min，柱温 20，流动相 A 在第 0、7、9、10 min所占比例分别是：0、20、25、0，进样量为 20 L。EC 参照 Liu 等方法计算11：EC=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。1.2.7桃果实线粒体的提取参照 Liang 等方法12。取 50 g 桃果肉，加入 100 mL提取液50 mmol/L pH 值为 7.5 Tris-HCl 缓冲液，内含0.25 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、质量分数为 0.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)于 4匀浆，然后用四层纱布过滤，滤液在 4下 4 000 g离心10 min；取上清液在4下14 000 g离心分离20 min；将沉淀用10 mL洗涤液（10 mmol/L Tris-HCl pH值为7.2，内含 0.25 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA）洗涤，再在 4下 4 000 g 离心 10 min；得到的上清在 4下 14 000 g 离心分离 20 min，得到的沉淀即为线粒体，用 1.5 mL 悬浮液（10 mmol/L Tris-HCl pH 值为 7.2，内含0.25 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA）悬浮。线粒体内蛋白含量用 Lorry 法测定。1.2.8线粒体 SDH 活性的测定参照 Ackrell 等13方法。测定样品的反应混合液内含有 0.2 mol/L pH 值为 7.4 磷酸钾缓冲液，0.2 mol/L pH 值为 7.4 琥珀酸钠，0.9 mmol/L 2,6-二氯酚靛钠（DCPIP）和蒸馏水。将反应混合液放置在 30条件下保温 5 min，然后加入线粒体制备液混匀，测定时加入质量分数为0.33%甲硫酚嗪(PMS)摇匀，于紫外分光光度计上测定DCPIP 在 600 nm 处的还原速度，以此来表示 SDH 活性。1.2.9线粒体 CCO 活性的测定参照熊杰等方法14。取线粒体制备液 0.2 mL，加入质量分数为 0.04%细胞色素 C 水溶液 0.2 mL，重蒸水2 mL。将试样在 37预热 2 min，加入 0.5 mL 质量分数为 0.4%二甲基对苯二胺溶液。用秒表记下反应开始的时间，保温 3 min，至出现红色，颜色在 10 min 内稳定，于510 nm 比色，以每分钟吸光值变化 0.1 为 1 个活性单位，结果以 U mg-1protein 表示。1.2.10线粒体 H+-ATPase 酶活性的测定参照何飞龙等方法15。3 mL 的反应体系中含有30 mmol/L Tris-HCl pH 值为 8.0，3 mmol/L Mg2SO4，0.1mmol/L Na3VO4，50 mmol/LNaNO3，50 mmol/L KCl，0.1mmol/L 钼酸铵，加入线粒体制备液，然后加入 30 mmol/LATP-Tris（pH 值为 8.0）启动反应，并立即放置于 37水浴锅中反应 20 min，再用质量分数为 55%的三氯乙酸（TCA）终止反应。无机磷的测定参照 Lanzetta 等方法16测定。以释放出无机磷的量来表示 H+-ATPase 活性。1.2.11线粒体 Ca2+-ATPase 酶活性的测定参照何飞龙等方法15。3 mL 的反应体系中含有30 mmol/L pH 值为 8.0 Tris-HCl，0.1 mmol/L Na3VO4，50 mmol/L NaNO3，50 mmol/L KCl，0.1 mmol/L 钼酸铵，加入线粒体制备液，以加或不加 3 mmol Ca(NO3)2引起的酶活性之差表示线粒体 Ca2+-ATPase 酶活性，然后加入30 mmol/L ATP-Tris（pH 值为 8.0）启动反应，之后步骤与 H+-ATPase 酶活性测定相同，也以释放出无机磷的量来表示 Ca2+-ATPase 活性。1.3统计与分析试验数据统计分析采用 SPSS 统计软件，结果用平均值 标准差（SE）表示，差异显著性检验采用邓肯多重比较法，差异显著水平为 0.05。2结果与分析2.1不同贮藏温度下桃果实褐变指数的变化由表 1 可知，桃果实在不同冷藏温度下冷害发生程度不同。10贮藏下的桃果实无冷害褐变发生，但贮藏20 d 时果实已经完全腐烂。0 和 5贮藏果实分别在 20和 15 d 时出现褐变，并随着贮藏时间增加褐变指数持续表 1不同贮藏温度下桃果实褐变指数的变化Table 1Changes of internal browning index of peaches atdifferent storage temperatures褐变指数贮藏温度/15 d20 d25 d30 d00b0.03 0.02b0.15 0.02b0.43 0.02b20.07 0.02a0.16 0.03a0.35 0.01 a0.71 0.02a100b0c注：同列不同字母表示有显著差异(P0.05)，为果实已完全腐烂并无冷害症状。第 4 期陈京京等：低温贮藏对桃果实冷害和能量水平的影响277上升，5贮藏的果实尤为明显，30 d 后果实的褐变指数已高达 0.71，比 0高 66%。2.2不同贮藏温度下果实硬度和出汁率的变化由图 1a 可见，在整个贮藏期间桃果实硬度随贮温的升高而显著降低，且贮温越高硬度下降越快。10贮藏时随着贮藏时间增加，桃果实迅速软化，导致硬度急剧下降；5下果实硬度持续平稳下降；0贮藏的桃果实硬度下降缓慢，在贮藏后期有所增加，这可能与 0贮藏后期果实不能后熟有关。各贮藏温度下出汁率的变化趋势如图 1b 所示，10下果实出汁率持续上升，0 和 5贮藏果实出汁率呈现先上升后下降趋势，5下果实出汁率 15d 开始下降，而贮藏于 0下果实出汁率 20 d 才有所下降，这与果实发生冷害褐变的时间相一致。图 1不同贮藏温度下桃果实硬度和出汁率的变化Fig.1Changes of firmness and extractable juice rate of peaches at different storage temperatures2.3不同温贮藏度下果实相对电导率和丙二醛含量的变化桃果实相对电导率在不同冷藏温度下逐渐增加，5贮藏果实相对电导率显著高于 0 和 10贮藏果实（P0.05），30 d 时已高达 87%，比 0贮藏果实高 30%（图 2a），说明 5下果实细胞膜透性增加最大。MDA作为膜脂过氧化产物，在果蔬的贮藏过程中由于衰老或冷害的发生，其含量不断增加。从图 2b 可以看出，桃果实在贮藏过程中 MDA 逐渐积累，5贮藏果实 MDA 含量增加最显著（P0.05），表明 5下果实膜脂过氧化最严重。图 2不同贮藏温度下桃果实相对电导率和丙二醛含量的变化Fig.2Changes of relative conductivity and MDAcontent of peaches at different storage temperatures2.4不同温贮藏度下桃果实 ATP、ADP、AMP 含量和能荷的变化从图 3a，b 可以看出，桃果实在 5 和 0贮藏过程中ATP、ADP 含量持续下降，5贮藏下降最显著（P0.05），整个贮藏过程中 ATP 含量由 43.36 nmol/g FW 下降到8.71 nmol/g FW，30 d 时果实 ATP 含量比 0低 59%。贮藏于 10下的桃果实，ATP 含量先升高后下降，ADP 下降幅度不大。三个温度下 AMP 含量都是升高的，以 5贮藏增加最多，0贮藏的增加最少（图 3c）。不同冷藏温度下桃果实能荷值变化如图 3d 所示，5 和 0下桃果实能荷值呈下降趋势，10下果实能荷值前 9 d 稍有升高，之后开始下降，这与 ATP 含量变化相一致，可能与果实进入衰老期有关。与 0相比，5下果实能荷值下降显著（P0.05），从采收时到贮藏末期由0.69降到0.37，30 d 时能荷值比 0低 38.5%，整个贮藏过程中，5贮藏果实能荷值始终低于 0果实，说明 5贮藏果实能量水平最低，能量亏缺最严重。农业工程学报2012 年278图 3不同贮藏温度下桃果实 ATP、ADP、AMP 含量和能荷的变化Fig.3Changes ofATP、ADP、AMP contents and energy charge of peaches at different storage temperatures2.5不同贮藏温度下果实 SDH 和 CCO 活性的变化不同冷藏温度下桃果实 SDH 活性变化如图 4a 所示。10贮藏时果实 SDH 活性逐渐升高，整个贮藏过程中 5贮藏果实 SDH 活性始终低于 0。不同温度下桃果实CCO 活性随着贮藏时间增加逐渐下降，其中 0贮藏果实 CCO 活性下降较缓慢，5下降显著，30 d 时已下降了 81%（图 4b）。整个贮藏过程中 5 贮藏果实 SDH 和CCO 活性都显著小于 0和 10(P0.05)。SDH 和 CCO活性的下降会阻碍三羧酸循环和呼吸链的顺利进行，从而导致线粒体功能障碍，影响能量生成效率。图 4不同贮藏温度下桃果实琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶活性的变化Fig.4Changes of activities of SDH and CCO of peaches at different storage temperatures2.6不同贮藏温度下果实H+-ATPase和Ca2+-ATPase酶活性的变化由图 5a 可见，10贮藏果实 H+-ATPase 酶活性先升高后下降，但0和5贮藏果实该酶活性一直呈下降趋势，其中 5贮藏果实 H+-ATPase 下降更为迅速，到贮藏末期比 0果实低 51%。Ca2+-ATPase 酶活性在 3 个贮藏温度下都呈持续下降趋势，以10贮藏Ca2+-ATPase 酶活性下降最显著，这可能是其不耐贮藏的原因之一，5下Ca2+-ATPase酶活性下降比 0要显著(图 5b），表明 5下果实线粒体合成 ATP 能力下降，线粒体内环境平衡遭到破坏。第 4 期陈京京等：低温贮藏对桃果实冷害和能量水平的影响279注：H+-ATPase 和 Ca2+-ATPase 酶活性以磷的释放量来表示。图 5不同贮藏温度下桃果实 H+-ATPase 和 Ca2+-ATPase 活性的变化Fig.5Changes of activities of H+-ATPase and Ca2+-ATPase of peaches at different storage temperatures3讨论果肉褐变是桃果实的主要冷害症状之一,褐变指数能够直观反映出果实冷害的发生情况；而相对电导率和MDA 含量的升高通常被认为是细胞膜受损的重要标志。在本研究中，5贮藏下的桃果实褐变发生最严重，细胞膜透性增加最快，膜脂过氧化产物 MDA 积累最多。组织褐变的发生主要是由于酚类物质在多酚氧化酶（PPO）存在下被氧化造成的。在正常组织中，酚类物质与 PPO 是区域分布的，当细胞膜遭到破坏后会使 PPO 和酚类物质接触，从而导致褐变发生17。有研究发现龙眼果实在衰老过程中，由于能量缺失导致细胞膜完整性遭到破坏，从而引发褐变7。采用外源 ATP 处理可增加果实组织中的能量水平，可较好地维持细胞膜结构的完整性，减轻组织褐变的发生9,18。在本研究中，5贮藏果实 ATP、ADP 含量和能荷水平下降最快，冷害褐变发生最严重。在整个冷藏过程中褐变程度与能量水平呈负相关，即能量水平越低，褐变发生越严重，并在冷害发生时 ATP 及能荷水平下降更为迅速，相对电导率升高更快，MDA 积累更多。而 0贮藏果实组织能量水平显著高于 5贮藏果实，其相对电导率增加缓慢，膜脂过氧化产物 MDA 积累较少，较好维持了细胞膜完整性，减轻冷害发生。10下贮藏的桃果实保持较高的能量水平，在整个贮藏期间无冷害发生。这些结果表明桃果实冷害发生与能量亏缺有密切关系。线粒体是细胞能量代谢和物质转化的中枢。线粒体产生能量的能力随着机体的衰老而减弱，当大量的线粒体受到损伤后，线粒体功能出现障碍，能量合成受到抑制，导致细胞能量供应不足，进而加速机体的衰亡19。H+-ATPase 是细胞膜质子泵，通过外泌 H+产生跨膜电化学梯度，建立跨膜质子推动力pH，在跨膜质子电动势的催化下合成 ATP。Ca2+-ATPase 是细胞器膜上的 Ca2+泵，可以将细胞内 Ca2+泵到细胞外，维持细胞内 Ca2+浓度，是维持细胞稳态的重要机制之一,细胞质内 Ca2+过量积累则会打破了线粒体内环境平衡，导致线粒体功能障碍14。SDH 酶位于线粒体内膜上，三羧酸循环顺利进行的主要酶之一，为细胞能量生成和生命活动所必须。1050 mol/L 浓度范围内Ca2+能提高鼠肝线粒体 SDH 活性，从而抑制了组织细胞能量下降20。CCO 是线粒体电子传递链末端氧化酶，能够将电子传递到 O2，为氧化磷酸化提供能量。如果 CCO 缺失或其功能障碍将会导致线粒体呼吸链电子传递中断，使 ATP 生成减少，细胞生命活动所需能量供应不足；另外呼吸电子传递链障碍会导致氧化不完全也会造成活性氧（ROS）生成增多，这些均可导致细胞死亡21。在本研究中发现，桃果实发生冷害时H+-ATPase、Ca2+-ATPase、SDH 和 CCO 等线粒体呼吸代谢酶活性下降，ATP、ADP 和能荷水平降低，细胞膜透性增加，膜脂过氧化加剧，褐变发生加重。特别是 5贮藏果实的 ATP 和 ADP 含量、能荷水平、H+-ATPase、SDH和 CCO 活性最低，冷害褐变最严重。这些结果表明，线粒体呼吸代谢酶活性下降破坏了线粒体结构和功能，影响线粒体产能效率，造成细胞能量亏缺，从而引发果实的冷害。5贮藏的桃果实能量水平显著低于 0贮藏果实，其直接原因与 H+-ATPase 等线粒体呼吸代谢相关酶活性受到抑制有关，但其深层次的原因和机理还有待进一步研究。4结论1）贮藏于 5下的桃果实 ATP、ADP 含量和能荷值最低，细胞能量亏缺最严重，其冷害发生最严重；0贮藏果实保持相对较高的能量水平，冷害发生较轻。表明桃果实冷害发生与能量亏缺有密切关系，能量亏缺越多，冷害发生越严重。2）桃果实在冷藏过程中琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（CCO）、H+-ATPase 和 Ca2+-ATPase 等线粒体呼吸代谢酶活性降低，从而影响能量合成，导致细胞能量供应不足，5贮藏果实线粒体呼吸代谢酶活性下降最快，细胞能量水平最低，冷害最严重。参考文献1王友升，王贵禧，梁丽松.不同气体成分贮藏对大久保桃果实品质的影响J.农业工程学报，2006，22(8)：2142188.Wang Yousheng,Wang Guixi,Liang Lisong.Effects ofvarious O2and CO2concentrations on the quality of Okubaopeach fruit during storage J.Transactions of the农业工程学报2012 年280CSAE,2006,22(8):2142188.(in Chinese with Englishabstract)2蔡琰，余美丽，邢宏杰，等.低温预贮处理对冷藏水蜜桃冷害和品质的影响J.农业工程学报，2010，26(6)：334338.Cai Yan,Yu Meili,Xing Hongjie,et al.Effects of lowtemperature conditioning on chilling injury and quality ofcold-stored juicy peach fruit J.Transactions of the CSAE,2010,26(6):334338.(in Chinese with English 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varied among different storage temperatures.The chillinginjury was much more severe in fruits stored at 5 than at 0,while no chilling injury symptoms was observed inpeach fruit stored at 10.Moreover,peaches stored at 5 had lower contents of ATP,ADP,energy charge,activitiesof H+-ATPa