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Science and Technology of Food Industry生 物 工 程2014年第18期接种量对单增李斯特菌生长期及生长界面的影响周小红，李学英，杨宪时*，迟海（中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）摘要：为了初步了解接种量对单增李斯特菌生长状况及生长/非生长界面的影响，本实验对单增李斯特菌在0、4、10、25下通过培养菌液在600nm下的吸光光度值对其生长周期曲线分别进行了测定，并分析了不同接种量的单增李斯特菌菌液在25下的生长周期状况，探讨了纯培养条件下不同盐度和pH下，接种量对单增李斯特菌生长/非生长状况的影响。结果表明：不同的温度下，单增李斯特菌的生长周期有很大的差别；而在相同温度下，接种量对单增李斯特菌的生长周期有较大的影响，随着接种水平的降低，菌种生长所需的延滞时间越长，接种量为107CFU/mL时，其生长延滞期为04h，而当接种量减少为10CFU/mL时，其生长延滞期为016h；而对于单增李斯特菌的生长/非生长界面而言，接种量对其也有一定的影响，但其作用机制还有待进一步深入的研究。关键词：单增李斯特菌，接种量，生长期，生长界面Effect of inoculum size on growth phase and growth interface ofListeria monocytogenes under different cultural conditionsZHOU Xiao-hong，LI Xue-ying，YANG Xian-shi*，CHI Hai（East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China）Abstract：To preliminary understanding the influence of inoculation level on growth/no growth interface of Listeriamonocytogenes，the experiment was carried on 0，4，10，25 under 600nm absorption values to determine itsgrowth phase by its turbidity of bacteria liquid respectively，and the growth state of Listeria monocytogenes indifferent inoculum size under 25 was analyzed，and the effect of inoculation level on growth/no growthinterface of Listeria monocytogenes under pure cultivation combined with different salinity and pH was discussed.The results showed that there was a big difference among the growth of Listeria monocytogenes under differenttemperatures.And at the same temperature，inoculation level had a great influence on the growth of Listeriamonocytogenes.With the decrease of inoculation level，the lag phase required for bacterial growth wasprolonged.When the inoculation level was 107CFU/mL，its lag phase was 04h.However，its lag phaseincreased to 016h when the inoculation level reduced to 10CFU/mL In terms of growth/no growth of Listeriamonocytogenes，inoculum size also had certain influence on its interface，but the mechanism requires furtherspecific studies.Key words：Listeria monocytogenes；inoculum size；growth phase；growth interface中图分类号：TS201.3文献标识码：A文 章 编 号：1002-0306（2014）18-0180-05doi：10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.030收稿日期：20131120*通讯联系人作者简介：周小红（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。基金项目：农业部引进国际先进农业科学技术项目（2011-Z12）。单 核 细 胞 增 生 性 李 斯 特 菌（Listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌，LM）是目前国际公认的重要食源性病原菌之一，曾多次引起食物中毒事件，临床死亡率高达20%70%，WTO将其列为四大食源性致病菌之一1-2。它是一种人畜共患的致病菌，能引起人类脑膜炎、败血症等疾病，尤其对孕妇、新生儿、老年人以及免疫功能缺陷者具有较高的感染风险3。虽然发病率不高，但致死率（20%30%）4远高于其他常见食源性病原菌。虽然在国内基本还没有爆发由单增李斯特菌引起的严重中毒事件，但在国外时有此类相关报道，所以引起了广泛的关注和重视，国外对单增李斯特菌的研究也较多，但是有关接种量对单增李斯特菌生长状况的影响还相当有限，所以本文旨在探讨接种量对单增李斯特菌生长及生长/非生长状况的影响，以期为进一步建立单增李斯特菌在纯培养和实际产品中的生长/非生长模型奠定基础和提供参考依据。本文在0、4、10、25温度下通过菌液的OD600值对单增斯特菌的生长周期进行了测定，分析了不同接种量菌液在25下的生长周期状况，并探讨了纯培养条件下不同盐度和pH下，180生 物 工 程2014年第18期Vol.35,No.18,2014接种量对单增增李斯特菌生长/非生长状况的影响。旨在进一步建立纯培养条件下不同接种量下单增李斯特菌在不同温度、盐度和pH下的生长/非生长界面模型，为实际产品中单增李斯特菌生长/非生长模型的建立提供参考依据，预测和控制单增李斯特菌在食品中的污染。1材料与方法1.1材料与仪器实验菌种单核细胞增生李斯特菌（LM54001）购自中国药品生物制品研究所；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE），含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、脑心浸液（BHI）北京陆桥技术有限公司；邻苯二甲酸氢钾、硼砂、磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸等化学试剂（AR）国药集团化学试剂上海分公司。ESCO CA2-4A1型操作安全柜上海生叉仪器有限公司；YXQ-LS-50SII型全自动立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司；Sanyo MIR 150、153型恒温培养箱日本三洋科研设备公司；721型可见光分光光度计上海菁华科技仪器有限公司数显；Sanyo MIR 253、553高精度低温培养箱日本三洋科研设备公司；pHS-3C型数显酸度计上海伟业仪器厂；SA-960-II SHJ-系列净化工作台上海净化设备厂；LabMASTER-aw型水分活度仪瑞士Novasina公司；Power wave XS型酶标仪美国Bioteck公司。1.2实验方法1.2.1菌悬液的准备菌株采取斜面低温保藏法于4冰箱中保藏5。每月移种一次，实验前用无菌接种环挑取一至两环加入无菌TSB-YE液体培养基中，37下培养至菌液浓度达到108CFU/mL6-7，以作为菌悬液备用。1.2.2单增李斯特菌在不同温度和接种量下生长周期的测定选择0、4、10、25四个温度，参照PMP数据库的相关数据，通过分光光度计测定培养菌液的OD600值，分别对单增李斯特菌在该几个温度下的生长周期进行测定；取灭菌后的TSB-YE培养基无菌操作移取到灭菌的96孔板里，每个小孔分装200L，分别做四个平行8。将菌悬液分别稀释到10、103、105、107CFU/mL数量级，分别吸取50L到上述的小孔中，然后滴加50L的无菌石蜡油并盖上无菌塑料盖，置于25恒温箱中培养9-10，每两小时取出培养板放入微孔板扫描分光光度计中读取各孔在光波波长600nm下的OD值。1.2.3不同接种量下单增李斯特菌生长/非生长的测定基于前期实验的单因素实验11以及一些相关参考文献，选择温度25，盐度分别为0.5%、2.5%、4.5%、6.5%、8.5%，pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在接种量分别为10、103、105、107CFU/mL四个水平下对单增李斯特菌的生长与非生长状况进行了部分因子实验。根据实验设计，配制TSB-YE液体培养基，调节其盐度、pH到各实验所需的条件下，然后将各培养基分装到各个试管中，121下灭菌20min。将菌悬液分别以10倍梯度稀释到10、103、105、107CFU/mL的接种水平，单增李斯特菌的初始接种量通过涂布TSA-YE平板计算得到。各试管振荡混匀后放入相应温度的恒温培养箱，根据前期的实验结果，每组实验做两个平行，培养结束后观察各试管的混浊度。1.2.4单增李斯特菌生长/非生长的判定方法如果试管中菌液混浊度明显，则判定其生长，并记为1；对于菌液混浊度不明显或者有质疑的试管，则对该试管进行涂布确认，并将菌种培养48h后的菌落总数与初始接种菌数进行比较，如果最终的菌量比初始接种量多于0.5lg CFU/mL12，则判定单增李斯特菌生长，并记为1，否则记为0。对于实验结果与预测结果有偏差的实验数据，按上述方法再次进行重新测定确认，如果还是与预测结果不符，则作为异常点保留。2结果与分析2.1各温度下单增李斯特菌的生长曲线如图1所示，图（a）、（b）、（c）、（d）分别表示单增李斯特菌在0、4、10、25下的生长周期曲线，单增李斯菌在该四个温度下的生长稳定期分别为1220d、1218d、68d、2024h，由此可以看出，菌种在不同的温度下其生长周期是不同的，一般温度越低，生长所需的时间越长。所以在后期实验中，可分别选择不同温度下单增李斯特菌对应的生长稳定期作为菌液的培养时间。温度作为影响微生物生长最直接的因素之一，对菌种的生长有较大的影响，因此在实际产品贮藏过程中，可以适当提高和降低贮藏温度，再结合其他生长控制条件来控制菌种的生长。2.2不同接种量下单增李斯特菌的生长曲线如图2所示，接种量1、接种量2、接种量3、接种量4分别对应单增李斯特菌的菌液接种浓度为107、105、103、10CFU/mL，由图2可以看出，4条生长曲线中，接种的菌液浓度越高，菌种对应的生长延滞期越短。接种量为107CFU/mL的时候，其生长延滞期为04h；接种量为105CFU/mL的时候，其生长延滞期为08h；接种量为103CFU/mL的时候，其生长延滞期为014h；接种量为10CFU/mL的时候，其生长延滞期为016h。由此可以得出，接种量对于单增李斯特菌的生长周期有很大的影响。接种量不同的情况下，单增李斯特菌生长的延滞时间的差别，可针对实际产品中微生物污染率的不同，预测其致病性和食品的安全性。与腐败菌达到一定数量食品才会出现问题不同，致病菌处于任何生长期就有引起中毒的潜在危险，因此对于含有潜在致病菌和产毒素菌株的食品来说，描述接种量对其生长/非生长情况具有重要的意义。2.3不同接种量下单增李斯特菌的生长/非生长状况由表1表4可看出，在温度为25的环境下，当培养基的pH4.5时，在盐度为0.5%8.5%的范围内，接种量为10、103、105、107CFU/mL的菌液均不生长；当培养基的pH6.0时，在盐度为0.5%8.5%的范围内，181Science and Technology of Food Industry生 物 工 程2014年第18期pHNaCl（%）0.52.54.56.58.54.0000004.5000005.0110005.5111106.0111116.5111117.0111117.511111表125 环境下单增李斯特菌在接种量为10CFU/mL下的生长/非生长状况Table 1Growth and no growth state of Liseria monocytogenesunder 25 with inoculation level of 10CFU/mLpHNaCl（%）0.52.54.56.58.54.0000004.5000005.0100005.5100006.0111116.5111117.0111117.511111表225环境下单增李斯特菌在接种量为103CFU/mL下的生长/非生长状况Table 2Growth and no growth state of Lis monocytogenesunder 25 with inoculation level of 103CFU/mL图2 25下单增李斯特菌在接种量10、103、105、107CFU/mL下的生长曲线Fig 2 Growth curve of Liseria monocytogenes under 25 withinoculation level of 10，103，105，107CFU/mL时间（h）0481216202428320.80.70.60.50.40.30.20.10.0OD600值接种量1接种量2接种量3接种量4图1单增李斯特菌在0、4、10、25下的生长曲线Fig.1Growth curve of Liseria monocytogenes under0，4，10，25时间（d）02468 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 320.600.500.400.300.200.100.00OD600值（a）时间（d）02468 10 12 14 16 18 20 22 24 26 280.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000OD600值（b）时间（d）012345678910 11 121.0000.8000.6000.4000.2000.000OD600值（c）时间（h）0246810 12 14 16 18 20 22 24 261.2001.0000.8000.6000.4000.2000.000OD600值（d）接种量为10、103、105、107CFU/mL的菌液均生长，即pH6.0时，盐度和接种量对单增李斯特菌的生长基本没什么影响；而当4.5pH6.0时，菌液的浓度低于105CFU/mL时，例如接种浓度分别为10、103CFU/mL时，接种量为10CFU/mL的菌液对盐度和酸度的耐受性反而高于接种量为103CFU/mL的菌液，当接种菌液浓度为105CFU/mL和107CFU/mL，单增李斯特菌的生长与非生长状况基本没什么差异；而接种量为103CFU/mL和105CFU/mL作比较，可以看出菌液接种浓度越高，单增李斯特菌对盐度和酸度的耐受性越强。单增李斯特菌作为一种重要的食源性致病菌，国内外学者对其生长及生长动力学模型做了大量的研究，虽然在研究其微生物生长动力学中很少将接种量作为影响因子，但是有研究表明它可能对微生物的生长产生影响。Baranyi13、Baranyi和Pin14在其研究中表明随着接种的细胞数的减少，接种水平达到102103细胞数的菌液生长延滞期延长15。最新研究也表明接种量对于微生物开始能够生长这种能力具有的重要性，Robinson等的报道中指出单增李斯特菌182生 物 工 程2014年第18期Vol.35,No.18,2014pHNaCl（%）0.52.54.56.58.54.0000004.5000005.0110005.5111106.0111116.5111117.0111117.511111表325环境下单增李斯特菌在接种量为105CFU/mL下的生长/非生长状况Table 3Growth and no growth state of Liseria monocytogenesunder 25 with inoculation level of 105CFU/mLpHNaCl（%）0.52.54.56.58.54.0000004.5000005.0110005.5111106.0111116.5111117.0111117.511111表425环境下单增李斯特菌在接种量为107CFU/mL下的生长/非生长状况Table 4Growth and no growth state of Liseria monocytogenesunder 25 with inoculation level of 107CFU/mL开始生长所需的细胞数在理想生长条件下为1CFU/mL，在1.8mol/L浓度的NaCl作用下增加到105CFU/mL，类似的结论在降低pH和增加化学抗菌剂浓度的研究中也有报道16-17。因此本实验为了进一步了解和证实接种量对单增李斯特菌生长的影响，对其在10、103、105、107CFU/mL接种水平下的生长周期和生长/非生长状况做了研究。本实验先对单增李斯特菌在0、4、10、25下的生长曲线进行了测定，是为下一步生长与非生长模型的建立过程中各温度所需的培养时间提供一定的参考依据。另外接种量对单增李斯特菌生长期和生长/非生长状况的影响，通过实验得出结论，接种量对单增李斯特菌的生长周期有显著的影响，随着接种水平的降低，菌种生长所需的延滞时间越长，接种量为107CFU/mL时，其生长延滞期为04h，而当接种量减少为10CFU/mL时，其生长延滞期为016h；而对于单增李斯特菌的生长/非生长而言，接种量对其可能有一定的影响，当接种菌液浓度较低时，如10CFU/mL和103CFU/mL时，接种量低的菌液对环境的耐受性反而强于接种量高的菌液，这有可能受菌与菌之间的相互竞争影响，而当接种菌液浓度达到一定值时，接种量对其生长/非生长基本没有什么影响，如105CFU/mL和107CFU/mL接种量时，单增李斯特菌的生长与非生长状况基本没什么差异，而将接种量为103CFU/mL和105CFU/mL作比较，又得出菌液接种浓度越高，单增李斯特菌对盐度和酸度的耐受性越强，但差异也不是很明显，所以接种量对于微生物的生长与非生长界面可能有一定的影响，但其作用机制还有待进一步深入的研究。3结论实验表明温度不同，单增李斯特菌的生长周期有很大的差别，温度越低，延滞期的时间越长，这对于不同温度下确定微生物的致病性具有一定的参考意义；而在相同温度下，接种量对单增李斯特菌的生长周期有较大的影响，随着接种水平的降低，菌种生长所需的延滞时间越长，接种量为107CFU/mL时，其生长延滞期为04h，而当接种量减少为10CFU/mL时，其生长延滞期为016h，所以可以预测在实际产品中，致病菌的污染率不一样，其致病性也会有一些差别；而对于单增李斯特菌的生长/非生长界面而言，接种量对其也有一定的影响，但其在纯培养条件下波动性较大，变化趋势不是特别有规律，其作用机制还有待进一步深入的研究，而且在实际产品中其生长/非生长界面情况还会更复杂，所以需要更进一步的研究和探索。参考文献1 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monocytogenes affected bytemperature，pH and aw when grown in suspension or on a solidsurfaceJ.International Journal of Food Microbiology，2004，21183Science and Technology of Food Industry生 物 工 程2014年第18期17.40%。例如1-辛烯-3-醇、（E）-2，4-己二烯-1-醇、正辛醇、苯甲醇等醇类通常具有芳香、植物香，由于醇类的高含量赋予了河蚌酶解液MRPs原生的柔和的甜瓜味，同时具有蘑菇味和脂味10-11。在挥发性醇类中，（E）-2，4-己二烯-1-醇在河蚌酶解液中含量为0.32%，而在美拉德反应之后含量增加到了9.78%，（E）-2，4-己二烯-1-醇为C6醇，具有青香香气，有杏仁糖样的甜香和生杏仁、坚果样的香韵，并带有蔬菜和稍有威士忌的香调；在味觉方面，具有水果和热带水果风味，稍有青香和蔬菜韵味。在河蚌肉酶解液和MRPs中都检测到了2-乙基呋喃、2-甲基-3-甲硫基呋喃，在经过美拉德反应之后，2-乙基呋喃的含量有所上升，表现出强烈的焦香香味，略有甜味，而2-甲基-3-甲硫基呋喃的含量也有所上升，其为MRPs的整体柔和的风味的不可或缺的部分。在两个样品中还检测到了挥发性含硫化合物如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚的存在，在河蚌酶解液中检测到得二甲基硫在MRPs中未检测出，可能是在美拉德反应过程中生成了二甲基三硫醚等物质。多数含硫化合物的气味特征是洋葱味、卷心菜味、或煮沸的硫磺味和臭鸡蛋味，因其阈值低而影响整个食物的香味。在河蚌酶解液中还检测出了MRPs未检测出的4种酯类化合物，这可能是在美拉德反应中酯类化合物发生降解，生成了其他的物质。综上所述，结合感官评分和GS-MS成分分析，发现美拉德反应对河蚌肉酶解液的不良风味有了较好的改善，达到了去腥增香的目的。3结论河蚌肉酶解液中的挥发性风味成分很丰富，共检测出50种化合物，如醛类、醇类、酮类及含硫化合物等。美拉德反应后得到的风味料则含有较多的醛类、酮类等化合物，感官评定发现，美拉德反应提高了香气品质，使得肉香更加浓郁。通过比较美拉德反应前后的挥发性风味成分的变化，并将结果进行对照表明，河蚌肉酶解液的风味主要以醛类化合物为主，而MRPs的风味则增加了酮类、醇类化合物，使得风味更加圆润。如-吡喃酮含量的增加，同时苯甲醛的含量的减少，使得MRPs的风味更加丰富，更有层次感。结果表明，通过美拉德反应制得的产物的香味更加的浓郁，纯正，具有独特的肉香味，是醛类、酮类、醇类及含硫化合物等共同作用的结果，是一种富有营养的天然调味料，具有较好的工业化应用前景。参考文献1 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