蜂蜜中脯氨酸的测定-液相色谱法（标准稿）.pdf

ICS点击此处添加中国标准文献分类号中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T 2012XXXX蜂蜜中脯氨酸的测定-液相色谱法Determination of proline in honey byliquid chromatography点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）（本稿完成日期：）XXXX-XX-XX 发布XXXX-XX-XX 实施GB/T 2012XXXXI前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准的附录 A 为资料性附录。本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。本标准起草单位：农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）本标准主要起草人：李熠、张金振、吴黎明、薛晓锋、赵静、陈兰珍、周金慧、陈芳、黄京平、王鹏GB/T 2012XXXX1蜂蜜中脯氨酸的测定蜂蜜中脯氨酸的测定蜂蜜中脯氨酸的测定蜂蜜中脯氨酸的测定-液相色谱法液相色谱法液相色谱法液相色谱法1范围本标准规定了蜂蜜中脯氨酸含量的液相色谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中脯氨酸含量的测定。本方法的检出限和定量限分别为3.00 mg/kg和10.00 mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neq ISO 3696:1987）3方法提要试样中的脯氨酸用硼酸缓冲液提取后，经柱前衍生，液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。4试剂和材料4.1试剂4.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.1.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。4.1.3 四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯4.1.4 乙酸钠（C2H3O2Na.3H2O）：分析纯。4.1.5 乙酸（C2H4O2）：分析纯。4.1.6 硼酸（H3BO3）：分析纯。4.1.7 乙二胺四乙酸二钠（EDTA，C10H14N2O8Na2.2H2O）：分析纯。4.1.8 氢氧化钠（NaOH）：分析纯。4.1.9 磷酸（H3PO4）：分析纯。4.1.10 盐酸（HCl）：优级纯。4.2试剂配制4.2.1 NaOH 溶液（0.1 mol/L）：称取 2.00 g 氢氧化钠（4.1.8），溶于 500 mL 水中，摇匀，然后转移至聚乙烯容器中，密闭放置。4.2.2 乙酸钠缓冲液（0.1 mol/L）：称取 13.60 g 乙酸钠（4.1.4），溶解于 1 L 水中，用乙酸（4.1.5）调节 pH 至 7.2,过 0.45m 滤膜，抽滤脱气。4.2.3 硼酸缓冲液（0.1 mol/L）：称取 EDTA（4.1.7）0.1862 g，硼酸（4.1.6）3.0915 g，溶解于500 mL 水中，用 NaOH 溶液（4.2.1）调至 pH 8.0。4.2.4 盐酸溶液（0.1 mol/L）：取 8.33 mL 盐酸，定容至 1 L。GB/T 2012XXXX24.3标准品4.3.1 脯氨酸标准品（C5H9NO2）：L-脯氨酸，纯度99%。4.3.2 4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑（NBD-F，C6H2FN3O3）：纯度99%。4.4标准溶液配制4.4.1 NBD-F 溶液（100 mmoL/L）：称取 NBD-F（4.3.2）0.0183 g 于棕色液相进样瓶中，加入 1 mL 乙腈溶解，密封保存。4.4.2 脯氨酸标准储备液（1000 mg/L）：准确称取脯氨酸标准品 0.1000 g，用硼酸缓冲液（4.2.3）定容至 100 mL，配制成 1000 mg/L 的标准储备液。储备液贮存在 4 冰箱中，有效期 3 个月。4.5膜：0.22 m，水相。5主要仪器和设备主要仪器和设备主要仪器和设备主要仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。5.2分析天平：感量 0.01 g；0.001 g；0.00001g。5.3涡旋混匀器。5.4pH 计：测量精度0.02。5.5微量移液器。5.6恒温水浴锅。5.7注射器:1 mL。6试样的制备试样的制备试样的制备试样的制备将样品搅拌均匀，分出0.5 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并标明标记。将试样于4 下保存。7分析步骤分析步骤分析步骤分析步骤7.1提取准确称取1 g0.05 g，置于100 mL烧杯中，加入20.0 mL硼酸缓冲液（4.2.3），用玻璃棒轻轻搅拌均匀，使试样完全溶解，超声提取10 min。将溶液转移至50 mL容量瓶中，用硼酸缓冲液（4.2.3）定容至刻度，充分混匀后，0.22 m滤膜过滤，滤液待衍生。7.2衍生取200 L标准溶液或样品溶液于棕色液相色谱进样瓶中，分别加入70 L乙腈，30 L NBD-F溶液（4.4.1），盖好密封盖，涡旋混匀，置于60恒温水浴锅中避光衍生10 min，取出立即放入冰水中冷却，加入100 L 盐酸溶液（4.2.4）终止反应，混匀，在样品量无法满足仪器要求时，转移至内衬管中进样。7.3色谱测定7.3.1液相色谱参考条件a)色谱柱：C18，5 m，150 mm4.6 mm（i.d），或相当者；GB/T 2012XXXX3b)流动相：A：0.1 mol/L 乙酸钠缓冲液（4.2.2）+甲醇+四氢呋喃=900+95+5；B：甲醇；c)柱温：30；d)进样量：20 L；e)荧光检测波长：激发波长 470 nm，发射波长 530 nm。梯度洗脱程序见表 1。表 1梯度洗脱程序（VA+VB）时间A（%）B（%）流速（mL/min）0.0010001.00.5075251.07.0075251.08.0001001.010.0001001.012.0010001.015.0010001.07.3.2液相色谱测定用硼酸缓冲液（4.2.3）稀释标准储备液（4.4.2），依次配成40.00 mg/L，20.00 mg/L，10.00 mg/L，5.00 mg/L，2.50 mg/L，1.25 mg/L，0.625 mg/L的脯氨酸标准工作溶液。在上述色谱条件下，测定七个浓度水平标准工作溶液的峰面积，以峰面积对相应质量浓度绘制标准工作曲线，然后测定未知样品，用标准工作曲线对样品进行定量。样品溶液中脯氨酸的响应值应在仪器的线性范围内。脯氨酸的参考保留时间为5.6 min，脯氨酸标准溶液色谱图、空白溶液色谱图和蜂蜜样品色谱图参见附录A中图A.1、图A.2、图A.3.7.4平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5空白试验按上述步骤，对硼酸缓冲液（4.2.3）进行测定。8结果计算结果计算结果计算结果计算结果用色谱数据处理软件或按式（1）计算：Xp Vm.(1)式中：X 试样中脯氨酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；从标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V定容体积，单位为毫升（mL）；GB/T 2012XXXX4m样液所代表试样的质量，单位为克（g）。9准确度和精密度准确度和精密度准确度和精密度准确度和精密度9.1准确度本方法中脯氨酸添加浓度及其回收率的试验数据为：添加量 125.00 mg/kg500.00 mg/kg，回收率为90.23%90.70%。9.2精密度本部分的精密度数据按 GB/T 6379.2 的规定确定，在重复性条件和再现性条件下，获得的两次独立测试结果的标准差不超过重复性限 Sr和再现性 SR。蜂蜜中脯氨酸含量为 370.47 mg/kg 时，测得的重复性限 Sr=12.99，再现性限 SR=15.93。GB/T 2012XXXX5AA附录A（资料性附录）色谱图脯氨酸标准溶液色谱图（A.1）、空白溶液色谱图（A.2）和蜂蜜样品色谱图（A.3）图图A.1A.1 脯氨酸标准溶液色谱图（脯氨酸标准溶液色谱图（5.005.00 mg/Lmg/L）图图A.2A.2 空白溶液色谱图空白溶液色谱图图图A.3A.3 蜂蜜样品色谱图蜂蜜样品色谱图GB/T 2012XXXX6BB_