9-液相色谱法.pptx

第九章第九章高效液相色谱法高效液相色谱法High Pertormance Liquid ChromatographyFor Short：HPLC主主 要要 内内 容容9.1 高效液相色高效液相色谱的特点与的特点与仪器器9.2 基本原理与主要分离基本原理与主要分离类类型型9.3 固定相与流固定相与流动动相相9.4 液相色液相色谱谱的的应应用用9.5 离子色离子色谱谱法法9.1 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器9.1.1 高效液相色高效液相色谱法法简介介9.1.2 流程及主要部件流程及主要部件9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介一、概述：一、概述：高高效效液液相相色色谱谱法法（HPLC）是是20世世纪纪60年年代代末末70年年代代初初发发展展起起来来的的一一种种新新型型分分离离分分析析技技术术，随随着着不不断断改改进进与与发发展展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它它是是在在经经典典液液相相色色谱谱基基础础上上，引引入入了了气气相相色色谱谱的的理理论论，在在技技术术上上采采用用了了高高压压泵泵、高高效效固固定定相相和和高高灵灵敏敏度度检检测测器器，因因而具备而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。的特点。9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介二、高效液相色谱法的特点：二、高效液相色谱法的特点：特点：特点：高压、高效、高速高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高高效效液液相相色色谱法法比比起起经典典液液相相色色谱法法的的最最大大优点点在在于于高高速速、高高效效、高高灵灵敏敏度度、高高自自动化化。高高速速是是指指在在分分析析速速度度上比上比经典液相色典液相色谱法快数百倍。法快数百倍。由由于于经典典色色谱是是重重力力加加料料，流流出出速速度度极极慢慢；而而高高效效液液相相色色谱配配备了了高高压输液液设备，流流速速最最高高可可达达 103cmmin-1。例例如如分分离离苯苯的的羟基基化化合合物物，7个个组分分只只需需1min就就可可完完成成。对氨氨基基酸酸分分离离，用用经典典色色谱法法，柱柱长约170cm，柱柱径径0.9cm，流流动相相速速度度为30cm3h-1，需需用用20多多小小时才才能能分分离离出出20种种氨氨基基酸酸；而而用用高高效效液液相相色色谱法法，只只需需1h之之内内即即可可完成。完成。9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介高效液相色谱法与经典液相色谱法比较：高效液相色谱法与经典液相色谱法比较：气气相相色色谱法法分分析析对象象只只限限于于分分析析气气体体和和沸沸点点较低低的的化化合合物物，它它们仅占占有有机机物物总数数的的20。对于于占占有有机机物物总数数近近80的的那那些些高高沸沸点点、热稳定定性性差差、摩摩尔质量量大大的的物物质，目目前前主主要要采用高效液相色采用高效液相色谱法法进行分离和分析。行分离和分析。气气相相色色谱采采用用流流动相相是是惰惰性性气气体体，它它对组分分没没有有亲和和力力，即即不不产生生相相互互作作用用力力，仅起起运运载作作用用。而而高高效效液液相相色色谱法法中中流流动相相可可选用用不不同同极极性性的的液液体体，选择余余地地大大，它它对组分分可可产生生一一定定亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对组分分作作用用的的剧烈烈竞争争。因因此此，流流动相相对分分离离起起很很大大作作用用，相相当当于于增增加加了了一一个个控控制制和和改改进分分离离条条件件的的参参数数，这为选择最最佳佳分分离离条条件件提提供供了了极极大方便。大方便。高效液相色谱法与气相色谱法比较：高效液相色谱法与气相色谱法比较：9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介气气相相色色谱一一般般都都在在较高高温温度度下下进行行的的，而而高高效效液液相相色色谱法法则经常常可在室温条件可在室温条件下工作。下工作。总之之，高高效效液液相相色色谱法法是是吸吸取取了了气气相相色色谱与与经典典液液相相色色谱优点点，并并用用现代代化化手手段段加加以以改改进，因因此此得得到到迅迅猛猛的的发展展。目目前前高高效效液液相相色色谱法法已已被被广广泛泛应用用于于分分析析对生生物物学学和和医医药上上有有重重大大意意义的的大大分分子子物物质，例例如如蛋蛋白白质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类、植植物物色色素素、高高聚聚物物、染染料料及及药物物等等物物质的分离和分析。的分离和分析。高高效效液液相相色色谱法法的的仪器器设备费用用昂昂贵，操操作作严格格，这是是它的主要缺点。它的主要缺点。9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介9.1.1 高效液相色谱高效液相色谱法简介法简介9.1 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器9.1.1 高效液相色高效液相色谱法法简介介9.1.2 流程及主要部件流程及主要部件9.1.2 流程及主要部件流程及主要部件一、流程：一、流程：l为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒 度度 很很 小小 的的 固固 定定 相相（甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)9.3.2 液相色谱液相色谱流动相流动相四、选择流动相时应注意的几个问题：四、选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽尽量量使使用用高高纯纯度度试试剂剂作作流流动动相相，防防止止微微量量杂杂质质长长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（HPLC级试剂级试剂）（2）避避免免流流动动相相与与固固定定相相发发生生作作用用而而使使柱柱效效下下降降或或损损坏坏柱柱子子。如如使使固固定定液液溶溶解解流流失失；酸酸性性溶溶剂剂破破坏坏氧氧化化铝铝固固定定相相等。等。（3）试试样样在在流流动动相相中中应应有有适适宜宜的的溶溶解解度度，防防止止产产生生沉沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流流动动相相同同时时还还应应满满足足检检测测器器的的要要求求。当当使使用用紫紫外外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时流动相不应有紫外吸收。9.3.2 液相色谱液相色谱流动相流动相主主 要要 内内 容容9.1 高效液相色高效液相色谱的特点与的特点与仪器器9.2 基本原理与主要分离基本原理与主要分离类类型型9.3 固定相与流固定相与流动动相相9.4 液相色液相色谱的的应用用9.5 离子色离子色谱谱法法9.4 液相色谱的应用液相色谱的应用9.4.1 影响分离的因素影响分离的因素9.4.2 液相色液相色谱的的应用用9.4.3 液相制液相制备色色谱 在在高高效效液液相相色色谱谱中中,液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，则则速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/U较较小小，可可以以忽忽略略不不计计，即：即：H=A+C u 故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。一、影响分离的因素与提高柱效的途径：一、影响分离的因素与提高柱效的途径：9.4.1 影响分离的因素影响分离的因素液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，密密度度为为气气体体的的一一千千倍倍，故故降低传质阻力是提高柱效主要途径。降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。增加柱温来改善传质。改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改善分离的最直接的因素。9.4.1 影响分离的因素影响分离的因素 H=A+Cu二、二、流速：流速：流流速速大大于于0.5 cm/s时时，Hu曲曲线线是是一一段段斜斜率率不不大大的的直直线线。降降低低流流速速，柱柱效效提提高高不不是是很很大大。但但在在实实际际操操作作中中，流流量量仍仍是是一一个个调调整整分分离离度度和和出出峰峰时时间间的的重重要要可可选选择择参数。参数。气气相相色色谱谱中中的的固固定定液液原原则则上上都都可可以以用用于于液液相相色色谱谱，其其选选用用原原则则与与气气相相色色谱谱一一样样。但但在在高高效效液液相相色色谱谱中中，分分离离柱柱的的制制备备是是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。9.4.1 影响分离的因素影响分离的因素三、固定相及分离柱：三、固定相及分离柱：9.4.1 影响分离的因素影响分离的因素9.4.2 液相色液相色谱的的应用用9.4.3 液相制液相制备色色谱9.4 液相色谱的应用液相色谱的应用固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷流动相：正己烷流流 速：速：1.5 mL/min色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：示差折光检测器检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。9.4.2 液相色谱的应用液相色谱的应用 一、环境中有机氯农药残留量分析：一、环境中有机氯农药残留量分析：二、多环芳烃的分析：二、多环芳烃的分析：固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器9.4.2 液相色谱的应用液相色谱的应用9.4.1 影响分离的因素影响分离的因素9.4.2 液相色液相色谱的的应用用9.4.3 液相制液相制备色色谱9.4 液相色谱的应用液相色谱的应用 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。9.4.3 液相液相制备色谱制备色谱半半制制备备型型（柱柱内内径径8mm，长长度度1530cm，一一次次制制备备量量毫毫克克级）级）制制备备型型（柱柱内内径径2050mm，柱柱长长50cm，制备量达到克级），制备量达到克级）对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。9.4.3 液相液相制备色谱制备色谱一、色谱柱的柱容量（柱负荷）：一、色谱柱的柱容量（柱负荷）：二、液相制备色谱的方法：二、液相制备色谱的方法：收收集集组组分分时时，通通常常有有以以下下两两种情况：种情况：（1）可可获获得得良良好好分分离离，主主峰峰 使用制备柱，超载提高效率；使用制备柱，超载提高效率；（2）两两主主成成分分之之间间的的小小组组分分；超超载载，分分离离切切分分使使待待分分离离组组分分成成为为主主成成分分（富富集集）后后，再再次次分分离离制备。制备。9.4.3 液相液相制备色谱制备色谱三、制备型液相色谱：三、制备型液相色谱：制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。9.4.3 液相液相制备色谱制备色谱主主 要要 内内 容容9.1 高效液相色高效液相色谱的特点与的特点与仪器器9.2 基本原理与主要分离基本原理与主要分离类类型型9.3 固定相与流固定相与流动动相相9.4 液相色液相色谱谱的的应应用用9.5 离子色离子色谱谱法法9.5 离子色谱法离子色谱法9.5.1 离子色离子色谱法原理法原理9.5.2 离子色离子色谱装置装置类型型9.5.3 离子色离子色谱的的应用用离子色谱法离子色谱法(Ion Chromatography,简称简称IC)以以无无机机、特特别别是是无无机机阴阴离离子子混混合合物物为为主主要要分分析析对对象象,在在七七十十年年代代出出现现、八八十十年年代代迅迅速速发发展。展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。一、离子色谱法简介：一、离子色谱法简介：9.5 离子色谱法离子色谱法戴安戴安Ics-3000多功能离子色谱仪多功能离子色谱仪9.5 离子色谱法离子色谱法二、离子色谱法原理：二、离子色谱法原理：采采用用交交换换容容量量非非常常低低的的特特制制离离子子交交换树脂为固定相；换树脂为固定相；细细颗颗粒粒柱柱填填料料，高高柱柱效效；采采用用高高压压输液泵；输液泵；采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；本本底底电电导导抑抑制制（在在分分离离柱柱后后，采采用用抑抑制制柱柱来来消消除除淋淋洗洗液液的的高高本本底电导）；底电导）；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。离离子子交交换换原原理理，与与传传统统离离子子交交换的不同点：换的不同点：9.5 离子色谱法离子色谱法三、离子色谱具有以下优点：三、离子色谱具有以下优点：（1）分析速度快：）分析速度快：可在数分钟内可在数分钟内完成一个试样的分析；完成一个试样的分析；（2）分分离离能能力力高高：在在适适宜宜的的条条件件下下，可可使使常常见见的的各各种种阴阴离离子子混混合合物物分分离离；例例：使使用用双双柱柱法法，在在十十几几分分钟钟内内，可使七种阴离子完全分离。可使七种阴离子完全分离。（3）分分离离混混合合阴阴离离子子的的最最有有效效方方法。法。（4）耐耐腐腐蚀蚀，仪仪器器流流路路采采用用全全塑塑件，玻璃柱。件，玻璃柱。9.5 离子色谱法离子色谱法抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分分离离柱柱中中离离子子交交换换树树脂脂的的交交换换容容量量通通常常在在0.010.05毫毫摩尔摩尔/克干树脂。克干树脂。非抑制型非抑制型:当当进进一一步步降降低低分分离离柱柱中中树树脂脂的的交交换换容容量量(0.0070.07毫毫摩摩尔尔/克克干干树树脂脂)，使使用用低低浓浓度度、低低电电离离度度的的有有机机弱弱酸酸及及弱弱酸酸盐盐作作淋淋洗洗液液，如如苯苯甲甲酸酸、苯苯甲甲酸酸盐盐等等。检检测测器器可可直直接接与与分分离离柱相连，不需抑制柱。柱相连，不需抑制柱。9.5 离子色谱法离子色谱法四、离子色谱装置类型：四、离子色谱装置类型：阴离子分析阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流流动动相相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量流量138 mL/h。七七种种阴阴离离子子在在20分分钟钟内内基基本本上上得得到到完完全全分分离离，各各组组分分含含量在量在350 ppm。9.5 离子色谱法离子色谱法五、离子色谱应用：五、离子色谱应用：学 习 要 求掌握高效液相色掌握高效液相色谱的的检测器器类型。型。掌握高效液相色掌握高效液相色谱的主要分离的主要分离类型及型及应用用领域。域。掌握高效液相色掌握高效液相色谱固定相和流固定相和流动相的相的选择原原则。课 后 习 题一、一、选择题：1、4、5、7 二、填空二、填空题：3 三、三、简答答题：4、8、9