HPLC培训教材2讲述.pptx

色谱流动相概念介绍色谱流动相概念介绍 流动相导论流动相导论v溶剂系统可以是一种或多种水溶液 或有机溶剂携带样品流经色谱柱至检测器 当与样品发生相互作用时，样品则发生分离 v选择溶剂需考虑的问题 极性与溶剂强度 纯度、过滤、除气 与其他溶剂的互溶性 缓冲溶液与pH等梯度或梯度洗脱分析 流动相的要求v流动相应不改变填料的任何性质流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。v纯度纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。v必须与检测器匹配必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。v粘度要低（应粘度要低（应2cp100 um、传质速度慢、柱效低中期：薄壳型硅胶固定相v玻璃珠涂敷硅胶颗粒层 v30-40 um、孔径均一，渗透性好，溶质扩散性快 v高效、分离快速，但样品负载量低后期：全多孔微粒v2000溶于水溶于水分子量分子量2000溶于溶于 THF分子量分子量4 倍则更加保险倍数进进 样样进进 样样 量量全定量环进样全定量环进样准确，但浪费样品至少需要2.5倍进样体积的样品部分定量环进样部分定量环进样进样量 进样环体积的一半无层流效应的影响误差来源于进样针及操作人员使用内标法将可以提高进样的准确度检检 测测 器器 作用：作用：检测色谱柱流出物组份浓度的变化理想的检测器：理想的检测器：灵敏度高 对所有溶质都有快速的相应 不引起柱外谱带扩展 线性范围宽 对样品无破坏性 检测器响应对流量及温度变化不敏感检检 测测 器器 分分 类类v1）按原理分：为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。v2）按测量性质分：为通用型和专属型（又称选择性）。v通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。v专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。v3）按检测方式分：浓度型和质量型。v浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。v4）检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。检测器的噪音和漂移检测器的噪音和漂移 噪音和漂移反应了检测器的稳定性噪音和漂移反应了检测器的稳定性 噪音噪音 无溶剂通过检测器时，输出信号的变化 电路及泵的脉冲引起短噪音，不影响色谱峰的分辨率，但影响检测限 长噪音来自检测器本身、或流动池有气泡，温度及流量的变化也会引起长噪音 漂移漂移 基线随时间增加朝单一方向偏移 电源电压不稳、温度及流动相发生缓慢变化 对分析误差及检测能力有影响检测器的技术指标检测器的技术指标灵敏度灵敏度 检测器的主要性能指标，样品进入检测器的响应信号 灵敏度越高检测限越低检测限检测限 两倍噪音时所需要的样品量 检测限小、检测性能强、检测时所需要的样品少线性范围线性范围 检测信号与被检测物呈线性关系的范围 下限定义为两倍噪音紫外紫外-可见波长检测器可见波长检测器应用范围最广泛的检测器应用范围最广泛的检测器 大约占使用的70%紫外光区：190370nm；可见光区：370700nm特点特点 灵敏度高、噪音低、线性范围宽 为溶质型检测器、对流速和温度的变化不敏感 为选择性检测器，必须使用无紫外吸收的溶剂作流动相为浓度型检测器 为非破坏性检测器，可与制备色谱或其他设备串联 结构简单、维护方便I0IAbsorbedradiationTransmitted radiationIncident radiationReflectionbv A=log()=a b cIoI紫外紫外-可见波长检测器工作原理可见波长检测器工作原理朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：吸光度与化合物的浓度成正比检测器流通池检测器流通池ProStar 325 检测器检测器双光程设计双光程设计 适合高低浓度的检测 可用于制备色谱的线性放大 可更换式流量池 不需要复杂的校准程序示差折光检测器示差折光检测器 v通用型检测器 溶剂选择合适几乎可测所有的物质 v原理折射率：光在真空的速度和在某介质中的速度之比光 光由一种介质进入另一种介质时发生折射现象 折射率随温度升高而降低 同一介质对不同波长的光有不同折射率 示差折光检测器的特点示差折光检测器的特点 v属通用型检测器响应值取决于柱后流出液折射率变化 适合检测 v无紫外吸收的物质 v流动相溶剂具有高紫外吸收 v浓度敏感型检测器 响应信号与溶质浓度成正比 v中等灵敏度检测器 不适合痕量分析 示差折光检测器的特点（续）示差折光检测器的特点（续）v对压力、温度变化相当敏感 需配置柱温箱 v最常用的溶剂是水 不适合梯度洗脱 v检测要求 流动相组成须恒定 控制恒温 控制压力恒定 v出口处不可以加限流 装置 v检测器串联时，RI应 放在最后 水甲醇和水水甲醇和水CH3CN混合物折射率混合物折射率 泵的维护保养（每日）泵的维护保养（每日）v每日维护保养检查并记录压力是否在正常范围 使用完毕后清洗流程 v先以水清洗v再以 ACN 或 MeOH 清洗v并且将有机溶剂保留在系统中 v避免细菌滋生v每周维护保养 若使用缓冲溶液必须清洗比例阀若 v先以水清洗v再以 ACN 或 MeOH 清洗以水清洗 piston seal检查溶剂瓶过滤头是否畅通 v每月维护保养以超声波、蒸馏水清洗溶剂瓶 检查 prime 是否困难以观察出口阀滤膜是否堵塞 泵的维护保养（每周、月）泵的维护保养（每周、月）六通阀使用和维护注意事项v样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。v转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。v为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。泵的简易故障排除泵的简易故障排除v分析柱压力每日记录 v电源开启失败检查插头、电线及保险丝 v开启后仪器自检 若失败，请记录 Error Log （视机型而定）检查操作手册泵的简易故障排除泵的简易故障排除 压力压力过高过高v压力过高混合室 0.5um 滤膜阻塞，更换滤膜 色谱柱或预柱的 frit 阻塞，倒冲或更换 frit，样品与溶剂需 过滤不恰当的流速，检查管柱 ID以及溶剂程序 高黏度溶剂，开发方法、改变 溶剂黏度 管路系统阻塞，从检测器往输液泵检查，找出问题点。输液泵简易故障排除输液泵简易故障排除 压力过低v压力显示过低 未进行 prime，入口管路存在空气 purge 和 prime 阀未关好 系统漏，检查接头处 活塞漏，观察溶剂是否从泵头 后面漏出 出口或入口单向阀损坏、更 换新阀比例阀阻塞，操作时听不到比例阀 工作的声音 溶剂瓶中的溶剂太少，检查入口管线是否有气泡 溶剂瓶内过滤头阻塞，更换或清洁滤头 与检测器有关的故障及其排除v1）流动池内有气）流动池内有气v基线上出现许多线状“峰”，v这是由于系统内有气泡需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，气泡停留在流动池内也可能使噪音增大，v2）流动池被污染）流动池被污染v无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。v可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用磷酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。v3）光源灯出现故障光源灯出现故障v紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。v4）倒峰）倒峰v检测器的极性接反了，v用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。v紫外检测器，如果流动相中含有紫外吸收的杂质，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。v在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的 气泡引起的问题气泡引起的问题 v色谱峰保留时间、面积改变 溶剂瓶内气泡产生，引起输液不良 泵内产生气泡，引起输液不良 气泡引起的问题气泡引起的问题 色谱峰变形v色谱峰变形色谱柱内气泡产生、滞留 引起峰变形气泡引起的问题气泡引起的问题 噪声v针状、锯齿状噪声峰流通池内气泡产生、滞留 引起基线噪声 气泡引起的问题气泡引起的问题 基线波动大v紫外检测器基线波动大 气泡存在，其中氧溶解量过 多造成检测不良 紫外、荧光、示差折光检测 器 保留时间漂移保留时间漂移 系统有漏 流速变化 柱稳变化（或室稳变化），确认 柱温箱温度 不正确的梯度洗脱程序 色谱柱的固定相已发生改变 样品流出色谱柱后，再生时间 不足（柱后衍生）温度的影响v柱子的恒温精度要求在0.10.5之间，v不同的检测器对温度的敏感度不一样。紫外检测器一般在温度波动超过0.5时，就会造成基线漂移起伏。示差折光检测器的灵敏度和最小检出量常取决于温度控制精度，因此需控制在0.001左右，v微吸附热检测器也要求在0.001以内。示差折光检测器示差折光检测器特点特点对压力、温度的变化相当敏感对压力、温度的变化相当敏感 需加装柱温箱最常用的溶剂是水最常用的溶剂是水 不适用于梯度洗脱方式检测要求检测要求 流动相组成必须恒定压力恒定 出口端不能加装限流装置 检测器串联使用时，RI应放在最后人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。