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正常人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系
【摘要】 　　本研究检测凋亡受体Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ在人外周血淋巴细胞(PBL)增殖过程中的表达情况及其细胞周期特异性，并探讨其与凋亡受体途径介导的细胞周期特异性细胞凋亡的关联性。应用双参数流式细胞术检测人外周血淋巴细胞在G0期和经植物凝集素刺激(PHA)进入细胞周期后Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ的表达情况以及细胞周期特异性，同时检测肿瘤坏死因子α、抗Fas抗体诱导人外周血淋巴细胞的凋亡。 结果表明： 经植物凝集素刺激24小时后的外周血淋巴细胞Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达率较G0期外周血淋巴细胞分别增加了%，%，%，均具有显着性差异()，而且主要表达在G1期； 未经植物凝集素刺激的外周血淋巴细胞停留在G0期，TNFα和antiFas诱导后没有发生凋亡，而刺激后进入细胞周期的淋巴细胞经TNFα和antiFas诱导后发生凋亡，其凋亡主要在G1期。 结论： 凋亡受体在外周血淋巴细胞中的表达与凋亡受体途径介导的细胞凋亡有明显的量效关系，凋亡受体途径介导细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体表达的细胞周期特异性有关，细胞凋亡的发生与细胞是否进入细胞周期有关。
【关键词】 细胞周期　细胞凋亡 人外周血淋巴细胞 细胞增殖
　　Relationship of Apoptotic Receptor Expression in Normal Human Peripheral Blood Lymphocytes to Cell Apoptosis
Abstract The aim of this study was to detect the expression and cell cycle specificity of Fas,TNFRⅠand TNFRⅡ in human peripheral blood lymphocytes (PBL)， and to study the potential role of Fas ,TNFRⅠand TNFRⅡ in cell cycle specific apoptosis. The improved doubleparameter flow cytometry was used to detect the expressions of Fas, TNFRⅠand TNFRⅡ and cell cycle specificity in PBL which were incubated for 24 hours in the presence or absence of phytohaematoagglutinin (PHA) respectively. Apoptosis induced by IgM type antiFas and TNFα was detected by API method. The results showed that compared with PBL treated in the absence of PHA in G0 phase, the ratio of Fas, TNFRⅠand TNFRⅡ expressions in PHAstimulated PBL entering cell cycle increased %，%，% respectively (), and mainly appeared at G1phase; no apoptosis was induced by antiFas and TNFα in G0phase PBL cultured in the absence of PHA. On the contrary, the apoptosis was induced by antiFas and TNFα in PBL which entered cell cycle after stumulation with PHA and mainly initiated at G1Phase. It is concluded that there is evident doseeffect relationship between apoptotic receptor and receptormediated apoptosis. Moreover, the cell cycle specificity of receptormediated apoptosis is correlated with the cell cycle specific expressions of apoptotic receptor. The induction of apoptosis by apoptotic factors (antiFas and TNFα) depends on whether cell entering cell cycle or not.
Key words cell cycle; apoptosis; human peripheral blood lymphocytes; cell proliferation
J Exp Hematol 2007; 15(3):533-536
细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，是细胞的增殖的基础。细胞凋亡是机体维持正常细胞群体数量稳态的重要手段，它是基因调控的细胞程序性的死亡，是正常机体去除不需要的细胞的严格调控的生理过程［1］。细胞凋亡的途径主要包括线粒体途径和凋亡受体途径。凋亡受体途径介导的细胞凋亡是细胞凋亡的重要途径之一，当凋亡因子与凋亡受体结合后通过级联反应激活一系列的caspase，最终导致细胞凋亡［2］。本研究以人正常人外周血淋巴细胞细胞为研究对象，探讨凋亡受体在G0期PBL中和进入细胞周期后的PBL中的表达情况及其与凋亡受体途径介导PBL细胞凋亡之间的关联性。
中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系材料和方法
细胞及主要试剂
外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)取自健康志愿者。异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(Annexin V)植物血凝素(phytohaematoagglutinin, PHA)购自晶美公司， 肿瘤坏死因子(TNFα)为英国EC公司产品，抗Fas抗体(Clone DX2)、FITCFas、TNFRⅠ抗体、TNFRⅡ抗体是Becton Dickinson公司产品，淋巴细胞分离液为中国医学科学科院血液研究所产品。
细胞处理
取正常人外周血液10 ml，加等体积生理盐水，缓慢加于淋巴细胞分离液上， 300×g离心20分钟后，取白膜层，加少量生理盐水， 200×g离心10分钟，将清洗干净的淋巴细胞分别置于2瓶含有10 ml/L的胎牛血清、抗生素和RPMI 1640培养液中悬浮培养，1瓶加有丝分裂原植物凝集素，培养液中淋巴细胞应用终浓度为10 μg/ml，刺激其生长分裂，另1瓶不加PHA，悬浮培养24小时。
PHA刺激的外周血淋巴细胞(3×105/ml)分别加入TNFα(50 ng/ml)、antiFas( μg/ml)培养24小时后收获细胞；对照组(未加PHA的外周血淋巴细胞)做同样处理
Fas 、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达以及细胞周期特异性的检测
Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ的免疫荧光单标直接标记法标记 离心去除细胞培养液，用PBS(pH 7. 4)洗涤，悬浮制成单淋巴细胞悬液(1×106ml)，取50 μl该悬液加入荧光FITI标记的单克隆抗体 μl，对照组用PBS孵育，4℃避光反应1小时，用PBS 3 ml混匀， 80×g离心10分钟，弃上清，用PBS再洗1次,用500 μl PBS悬浮细胞，避光反应1小时后上流式细胞仪检测。
Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达的细胞周期特异性的免疫荧光双标直接标记法检测 前期Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ的标记同前，接着用1%不含甲醇的甲醛固定20分钟，用PBS 3 ml混匀， 80×g离心10分钟，弃上清，用PBS再洗1次，加PI液500 μl，避光反应1小时后上流式细胞仪检测。
细胞凋亡周期特异性的API法检测
向收获细胞加入Annexin VFITC 5 μl后， 室温避光30分钟，以预冷的binding buffer洗涤1次，加入1 ml 1%不含甲醇的甲醛，冰上固定30分钟后以binding buffer洗涤2次，加入 ml PI染液(50 μg/ml PI， 500 μg/ml digitonin， 10 mmol PIPES， 2 mmol CaCl2，　mol NaCl)，1小时后上流式细胞仪检测。
统计学处理
应用SAS　for windows统计分析软件进行t检验。
　　结 果
加入PHA的正常人外周血淋巴细胞进入细胞周期的鉴定
DNA直方图显示处于静止期的外周血淋巴细胞加入PHA后进入细胞周期出现了明显的S、G2-M期细胞(图1)。
Figure 1. Cell cycle change of PBL cultured in the absence of PHA and PBL stimulated with PHA for 24 hours.
Fas 、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达
正常人外周血淋巴细胞经PHA刺激后Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ 表达明显增高，即FITC标记的荧光高度增加(图2) ，并且Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ 表达率较G0期PBL分别增加了%，%，%，差异均具有显着性()(图3)。
Fas 、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达的细胞周期特异性
经PHA刺激后，正常人外周血淋巴细胞Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达在G1期(图4)。
细胞凋亡的细胞周期特异性
TNFα、 antiFas诱导的PHA刺激的外周血淋巴细胞，细胞凋亡发生在G1期，对照组未加PHA， 经TNFα、 antiFas诱导24小时后，没有明显的凋亡细胞(图5)。
讨 论
增殖与分化是正常机体生命活动发展的一面，其中细胞周期是增殖的前提和基础［3］，凋亡则是机体生命活动衰退的一面。凋亡和增殖分化对立统一于正常机体的生命活动之中。以前研究表明，细胞凋亡是一个细胞周期事件［4,5］。凋亡受体途径介导细胞凋亡是凋亡发生的主要途径之一。在此途径中，凋亡受体的表达以及参与细胞周期途径中的主要物质，如细胞周期蛋白等起着重要的作用 ［2,6］。但是，凋亡受体途径介导的细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体的表达是否有关，凋亡受体途径介导的细胞凋亡与细胞周期的运行之间存在着何种关联，一直未得以阐明。鉴于此，本实验室通过对PBL的凋亡受体表达及其是否进入细胞周期与诱导凋亡发生之间的关系进行了研究分析。
实验研究发现，在用TNFα、antiFas分别诱导G0期PBL和经PHA刺激后进入细胞周期的PBL时，G0期细胞未发生凋亡，而进入细胞周期后的PBL能发生凋亡。这一证据有力地证明了细胞周期与细胞凋亡之间的关系——即细胞只有进入细胞周期后才能诱导其凋亡。这一现象与我们在临床肿瘤化疗和生物学治疗中发现G0期肿瘤的耐药和复发与G0期细胞存在有关是相吻合的 ［7］。
在本实验过程中，我们对正常人凋亡受体表达的周期特异性和凋亡受体介导的细胞凋亡的周期性进行了分析和比较发现，凋亡受体的表达和凋亡受体途径介导的细胞凋亡均发生在G1期。这一现象可能说明，凋亡受体虽然广泛存在PBL各期，但是只有表达在G1期PBL细胞膜上的凋亡受体才为有功能的受体。S期，G2/M期的细胞膜上虽然也有凋亡受体的存在，但它们因没有功能而不能与凋亡因子结合，从而不能参与凋亡受体介导的细胞凋亡。结合以前的研究我们认为，只有G1期PBL细胞膜上才存在有功能的凋亡受体，只有在此情况下凋亡受体的凋亡区域才具有自我聚集而形成三聚体的趋向，而在其他各期PBL细胞则没有该功能［8］。同时，虽然G0期PBL表达有功能的凋亡受体，但因PBL未进入细胞周期，所以凋亡受体介导的细胞凋亡也不能发生。这一现象说明凋亡受体介导PBL凋亡必须同时具备两个条件： ①细胞膜上存在可以与凋亡因子相结合的有功能的凋亡受体； ②细胞已进入细胞周期。这一观点从侧面反映了cyclin、CDK的活性在凋亡受体介导的细胞凋亡中的作用，同时也阐明了凋亡受体途径介导细胞凋亡的细胞周期特异性的可能发生机制，当然这一观点还需要进一步论证和具体阐述。
在本实验中，我们还发现正常人PBL进入细胞周期后，其凋亡受体的表达量较G0期细胞表达量显着增加，说明凋亡受体途径介导的细胞凋亡与凋亡受体表达可能存在着量效关系，即凋亡受体途径介导的细胞凋亡率增加可能与细胞膜上凋亡受体的增加有关。而在临床肿瘤研究中发现，肿瘤转移与细胞膜表面上的凋亡受体表达量减少有关，从而逃避了凋亡因子诱导其凋亡［9，10］，本实验进一步论证了这一点。
综上所述，我们认为凋亡受体的表达与凋亡受体途径介导的细胞凋亡及其细胞周期特异性有关，而细胞是否进入细胞周期可能决定着细胞凋亡诱导成功与否。因为凋亡受体途径介导的细胞凋亡在肿瘤形成，自身免疫性疾病的发生和神经系统退化疾病的演变过程中担当着重要的角色 ［11 ］，本实验研究结果为通过调控凋亡受体介导的细胞凋亡而达到治疗疾病的目的提供了可靠的理论依据和方法。
【参考文献】
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11Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a doubleedged sword. Science, 2004; 306(5698):990-995