固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞中的类胡萝卜素.pdf

固相萃取!高效液相色谱法测定枸杞中的类胡萝卜素杨亚玲!，赵榆林，林强，缪明明，杨光宇#，尹家元#（$昆明理工大学生化学院，昆明%&#(；#$云南大学化学系，昆明%&)）摘要：研究了固相萃取富集和预分离，高效液相色谱测定枸杞中的类胡萝卜素的方法；枸杞中的类胡萝卜素用*+,-./0,-.+12345固相萃取小柱预分离，以*+!,-./0,-.+12345（6$)7&88，&!8）液相色谱柱为固定相，甲醇!四氢呋喃（(9）为流动相分离，用二极管矩阵检测器检测，检测波长为(&:8。方法标准回收率为)&;?文献标识码：文章编号：!#（#(）%!#&!6枸杞是一种重要的中药材，富含类胡萝卜素，具有补肾养肝润肺明目的作用。国内外已有不少学者研究过枸杞中的类胡萝卜素，但是这些研究只是对枸杞中个别类胡萝卜素作了鉴定 6。高效液相色谱技术的快速发展为植物成分研究提供了有力手段，并在类胡萝卜素分析中得到广泛应用(。高效液相色谱法测定枸杞中的类胡萝卜素已有报道，但样品制备大多采用溶剂萃取，操作较麻烦&。固相萃取技术在分析化学中用作样品富集和预分离已得到广泛应用5，)，该技术具有富集倍数高，溶剂消耗少，环境污染小的优点。本文研究了用固相萃取富集和预分离，高效液相色谱测定枸杞中的类胡萝卜素的方法，并用紫外二级管矩阵检测器作了辅助定性和峰纯度分析，已用于枸杞中类胡萝卜素的测定。实验部分$仪器和试剂美国*+,-/公司高效液相色谱仪，包括#%)分离系统（四元泵及自动进样器），)%二极管矩阵检测器，2ABB-:AC86#色谱管理软件；水为石英亚沸蒸馏水并用 2ABBA!D&超纯水仪处理，电阻（5 8E8）；甲醇和四氢呋均为 F4GH级（IA/J-.公司）；玉米黄素，玉米黄素单肉豆蔻酸脂，#!胡萝卜素，玉米黄素单棕榈酸脂，#!隐黄素棕榈酸脂，堇菜黄素双棕榈酸脂，玉米黄呋喃素双棕榈酸脂，花药黄素双棕榈酸脂，玉米黄素双棕榈酸脂标准（分别购于 IBCK+公司和 LAM8+公司，纯度 N)&;）。$#色谱条件色谱柱：*+,-./0,-.+12345液相色谱柱（6$)887&88，&!8）；*+,-./0,-.+12固相萃取小柱（8G，6 8M，6!8）；流动相为：甲醇!四氢呋喃（(9），流速为$&8GO8A:；检测波长为(&:8，进样体积#!G。上述色谱条件下标样和枸杞样品在(&:8 波长处的色谱图见图。$6样品处理称取枸杞样品$&M，用蒸馏水浸泡复水，然后加入$M P+#H=6在研钵中磨碎，用 6&8G 四氢呋喃超声振荡萃取 6 8A:，过滤，滤渣再用 8G 四氢呋喃洗涤#6 次，至滤渣为白色。合并滤液并定容到&8G，取#8G 试液，用水稀释到 8G，以 8GO8A:流速通过预处理好的固相萃取小柱，小柱离心脱水后，以 8GO8A:流速用#8G 四氢呋喃洗脱，洗脱液用$(&!8 针头过滤器过滤，进样G 分析。&#第#6 卷第%期#(年%月分析试验室HJA:-/-QRC.:+B RS:+BT/A/G+UR.+,R.TVRB$#6$PR$%#(W%!收稿日期：#6!&!5；修订日期：#6!5!%作者简介：杨亚玲（)%(W），女，副教授万方数据图!样和枸杞样品色谱图（枸杞样品，#标样）!#$!$%&()*#&)(+,+*)-.)&.（/）)-.+)(012,&345*3+（)）!%玉米黄素；&%玉米黄素单肉豆蔻酸脂；%!(胡萝卜素；)%玉米黄素单棕榈酸脂；*%!(隐黄素棕榈酸脂；+%堇菜黄素双棕榈酸脂；,%玉米黄呋喃素双腙榈酸脂&结果与讨论&$!分离条件的选择类胡萝卜素的分离需用溶剂强度较强的流动相，非水流动相为最常用的体系，试验了甲醇，乙腈，丙酮，四氢呋喃和二氯甲烷为分离枸杞中类胡萝卜素的流动相，结果表明，效果以甲醇和四氢呋喃混合溶剂最好，当甲醇与四氢呋喃的体积比例为（)-!），时枸杞中的类胡萝卜素可达到完全分离且分析时间相对较短，因此该试验选用甲醇(四氢呋喃（)-!）为流动相。&$&主要类胡萝卜素的定性及检测波长的选择枸杞样品中各种胡萝卜素的色谱峰均由其保留时间及二极管矩阵检测器所记录各峰的光谱图与标样对照确认；并对各个测定样品作了峰纯度分析，证明枸杞样品中各种胡萝卜素均达到完全分离，由二极管矩阵检测器所记录的色谱图可知，各类胡萝卜素最大吸收波长为：玉米黄素)*./，玉米黄素单肉豆蔻酸脂)*+./，!(胡萝卜素)*+./，玉米黄素单棕榈酸脂)*+./，!(隐黄素棕榈酸脂)*./，堇菜黄素双棕榈酸脂)+./，玉米黄呋喃素双棕榈酸脂)0./，花药黄素双棕榈酸脂)*&./，玉米黄素双棕榈酸脂)*+./。由于各类胡萝卜素最大吸收波长非常相近，且在)*1./处均有较大吸收，因此实验选择检测波长为)*1./。&$样品前处理类胡萝卜素稳定性较差，故植物样品中类胡萝卜素测定时样品前处理过程要避免加热、光照。传统的样品处理是用极性有机溶剂提取类胡萝卜素，冷冻除去固醇等，在充氮气条件下用!11 234 567溶液皂化脱脂，有机相用水反复洗涤后干燥，所得样品重新溶解在适当的溶剂中进行分析)，方法操作十分复杂且处理过程中类胡萝卜素有损失。故我们研究了用极性有机溶剂提取类胡萝卜素，固相萃取预分离的方法。试验了用甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等溶剂作为枸杞中的类胡萝卜素的提取剂，实验表明，只有用四氢呋喃才能使枸杞样品中的类胡萝卜素完全提取，因此实验选用四氢呋喃为提取溶剂。试验了超声浸取和振荡浸取提取枸杞中的类胡萝卜素，结果表明超声浸取效果明显优于振荡浸取，故实验选用超声浸取，对于 1$*2 的枸杞样品，用 1/4 以上的四氢呋喃超声浸取 1/8.可使样品中的类胡萝卜素完全溶出。固相萃取操作采用 9:;?真空提取装置，该装置每次可同时处理&1 个样，小柱活化和样品富集的流速均控制在!1/43/8.。如果用四氢呋喃浸出液直接通过小柱，会因溶剂强度过大而使类胡萝卜素不能在 A!0固相萃取小柱上充分保留，故样品需用水稀释降低溶剂强度以降低溶剂对类胡萝卜素的洗脱能力，实验表明，样品稀释*倍左右再过柱可使类胡萝卜素完全富集在小柱上。富集完后小柱可用洗脱剂洗脱。试验了甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇，四氢呋喃作洗脱剂，实验表明只有用四氢呋喃才能使枸杞样品中的类胡萝卜素完全洗脱且让洗脱剂控制在较小的体积，实验表明，用&/4 左右的四氢呋喃可使小柱上富集的类胡萝卜素完全洗脱，因此实验选用&/4 四氢呋喃洗脱。&$)回归方程、相关系数及检出限分别配制质量浓度分别为*1，!1，&$1，1$)，1B1023/4 的标准溶液，进样后计算出不同质量浓度下的峰面积，计算出回归方程。根据信噪比 3CD，测得各组分检出限。其组分中各类胡萝卜素回归方程线性关系较好，相关系数在 1$EEE!F 1$EEE0 之间，检出限在&*F)1.23/4 之间。&$*加标回收率及精密度准确称取相同枸杞两份，其中一份加入已知量类胡萝卜素标样，另一份不加，在相同条件下测定*次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表!。+&第&卷第+期&11)年+月分析试验室AG8.;=;HIJ.K IL M.KN=8=4#I:INOIK$&$CI$+!&11)%+万方数据表!方法精密度及回收率!#!$%&()(*+)+,%&*-&%(&)组分加入量!#!$测得量!#!$回收率#%&(#%（)*）玉米黄素!+,-,-!.玉米黄素单肉豆蔻酸脂!+!+!+!*玉米黄素单棕榈酸脂!+,/,/!01胡萝卜素!+,-,-!,1隐黄素棕榈酸脂!+,*,*!2堇菜黄素双棕榈酸脂!+,/,/!*玉米黄呋喃素双棕榈酸脂!+,-,-!-花药黄素双棕榈酸脂!+,2!+0!.玉米黄素双棕榈酸脂!+,*,*!3.-样品分析结果实际测定了几种枸杞样品中类胡萝卜素质量分数，枸杞样品按!0 样品处理方法处理，在选定色谱条件下进样.+!4 分析，结果见表.。表.样品中类胡萝卜素分析结果!#.&/&%0(+/(*+%&)12/)*3%*/&+*(,)(+)042&)!5#5组 分测定值宁夏枸杞1!宁夏枸杞1.宁夏枸杞10宁夏枸杞12玉米黄素02-.3.0!./*玉米黄素单肉豆蔻酸脂.-.0!0.3*0-0玉米黄素单棕榈酸脂2.3*-.-0!*.31胡萝卜素-0*3,*32/2/1隐黄素棕榈酸脂/.-3,/!.!3,!堇菜黄素双棕榈酸脂!.*!3.,-.02玉米黄呋喃素双棕榈酸脂!30.2*.-*.,花药黄素双棕榈酸脂0.-0,.!0,.玉米黄素双棕榈酸脂/3-,/-3*-!+.*参考文献!白寿宁包装与食品机械.+，!3（.）：!3.沈泳，钱大玮营养学报，!,+，!.（2）：2.+0 高昆玉编著 色谱法在精细化工中的应用 北京：中国石化出版社!,-，0,2 李忠，彭光华色谱，!,/，!*（-）：*0/*王春芳，鲁静 药物分析杂志，!,/，!/（*）：0.!-56789:;?，9AB9;C D E6:FAG EH I$:;B6GJ6:AG AFKDEEK L9E6:FAG EH L9:E7AJE$:A891;B B;FB，.+0，2!（!）：0-3 胡秋芬，杨光宇，黄章杰等 分析化学，.+.，0+（*）：*-+6/1,7*+,&/&%0(+/(*+*3%*/&+*(,)(+3%18/1)#7)*2(,49)&:/%/(*+,9(59 4&%3*%0+&2(;1(,9%*0/*5%497()*%1&+,，-.(/01&+，12)3+%,，42(/4+,1!+,，()*0%,150 AFK2)6+%150%（RF=J;J6J EH S;EGE$;B AFK L97;BAG TF$;1F:;F$，6F7;F$UF;V:=;JM EH B;FB W XB9FEGE$M，6F7;F$-*+.2），DFY;9;MAF=9;，.+2，.0（-）：.*Z./#)/%/：I 9;$9 8:HE:7AFB G;6;K B9:E7AJE$:A89M（54L）7J9EK HE:J9 KJ:7;FAJ;EF EH BA:EJFE;K=;FH:6BJ6=A=J6K;K X9 BA:EJFE;K=:YJ:ABJK H:E7H:6BJ6=;J9 JJ:A9MK:EH6:AF（X5D）M 6GJ:A=EF;BAJ;EFX9 BA:EJFE;K=:=8A:AJK M=EG;K 89A=YJ:ABJ;EF;J9 OAJ:=_J:AX?&!3BA:J:;K$AFK;J9 7J9AFEG1JJ:A9MK:EH6:AF（2 !）A=7E;G 89A=AJ A HGE1:AJ EH+*74#7;F，AFK 7EF;JE:K;J9 89EJEK;EK A:AM K1JBJE:AJ 2*+F7 X9:BEV:;=EH J9 BA:EJFE;K=:,*%Z!+0%，AFK:GAJ;V=JAFKA:K KV;AJ;EF=:!a.%Z!,%X9;=7J9EK A=A88G;K JE J9 KJ:17;FAJ;EF EH BA:EJFE;K=;F H:6BJ6=;J9=AJ;=H;BJE:M:*%,)：5;$9 8:HE:7AFB G;6;K B9:E7AJE$:A89M；EG;K 89A=YJ:ABJ;EF；LA:EJFE;K=；D:6BJ6=/.第.0 卷第-期.+2 年-月分析试验室L9;F=E6:FAG EH IFAGM=;=4AE:AJE:MbEG.0cE-!.+2 d-万方数据