优化高效液相色谱测定玉米青贮饲料中有机酸条件的研究_刘瑞芳.pdf

检测技术NO.02 2023113饲料研究 FEED RESEARCH优化高效液相色谱测定玉米青贮饲料中有机酸条件的研究刘瑞芳 王艺伟（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100）摘要：研究旨在优化高效液相色谱仪测定玉米青贮饲料中有机酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量的最佳条件。试验以玉米青贮为试验材料，优化高效液相色谱法中的流动相配比、流速及柱温等条件，从而提高有机酸分离效果，缩短检测时间。结果显示，在甲醇KH2PO4（0.01 mol/L）=1090、流速1.0 mL/min、柱温30 的条件下，青贮饲料中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分别为2.618、1.569、0.712、0.056 g/L，检测结果的变异系数为1%3%，样品回收率为99.7%102.5%，标准偏差（RSD）为0.16%0.34%。研究表明，优化后的条件测定玉米青贮饲料中4种有机酸的分离效果理想，精密度高，回收率好。关键词：高效液相色谱；有机酸；玉米青贮中图分类号：S 816.5 文献标识码：A 文章编号：1002-2813（2023）02-0113-04 Doi：10.13557/ki.issn1002-2813.2023.02.023Optimization of conditions for determination of organic acids in corn silage by HPLCLIU Rui-fang WANG Yi-weiAbstract:The study was to optimize the optimum conditions for simultaneous determination of organic acids(lactic acid,acetic acid,propionic acid and butyric acid)in corn silage by HPLC.Corn silage was used as the test material to optimize flow compatibility ratio,flow velocity and column temperature in HPLC,to improve the separation effect of organic acids and shorten detection time.The results showed that under the conditions of methanolKH2PO4(0.01 mol/L)=1090,flow rate 1.0 mL/min and column temperature 30,the content of lactic acid,acetic acid,propionic acid and butyric acid in silage were 2.618,1.569,0.712 and 0.056 g/L,respectively,and the coefficient of variation of test results were 1%3%.The recoveries were 99.7%102.5%,and RSD were 0.16%0.34%.The study indicates that the optimized conditions for the determination of four kinds of organic acids in silage have ideal separation effect,high precision and good recovery.Key words:HPLC;organic acids;corn silage有机酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）是饲料青贮过程中微生物作用下的产物1。乳酸是反映青贮质量的重要指标，乳酸和乙酸是导致青贮过程中pH值下降的主要因素；丙酸具有抑制真菌的作用，可防止二次发酵；丁酸与青贮饲料腐败程度有关。有机酸含量是评定青贮饲料质量的重要指标2-3。青贮饲料中有机酸检测方法有酶法、薄层色谱法、气相色谱法、离子色谱法、高效液相色谱法等4-6。高效液相色谱法因具有操作简单、准确度高、可以同时测定多种有机酸等优点而广泛应用。本试验旨在优化测定4种有机酸定性、定量检测的高效液相色谱检测方法，为相关研究与应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料玉米青贮由西北农林科技大学实验教学基地提供，采用四分法进行采样。1.2主要试剂乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醇、乙腈，均购自北京预维科技有限公司；磷酸、磷酸二氢钾，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；试验用水为超纯水。1.3主要仪器Hitachl-2000 高效液相色谱分析仪购自日立公司，7693A 进样器、LC2030 紫外检测器购自安捷伦公司，Millipore超纯水机购自默克密理博有限公司，Allegra高速离心机购自克曼公司，ATY220分析天平购自岛津有限公司，KQ-600E超声波清洗器购自山市超声仪器有限公司，PHS-3C pH计购自赛多利斯科学仪器（北京）公司，ZDP-250恒温振荡箱购自上海精宏实验设备有限公司。第一作者：刘瑞芳，硕士，实验师，研究方向为动物营养与饲料科学。基金项目：西北农林科技大学实验技术研究项目（项目编号：SY20210228）；西北农林科技大学教学改革研究项目（项目编号：JY2103043）收稿日期：2022-04-29检测技术NO.02 2023114饲料研究 FEED RESEARCH1.4试验方法1.4.1标准曲线的绘制配制不同质量浓度的乳酸、乙酸（1、2、3、4、5 g/L），丙酸、丁酸（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）的混合标样，经0.45 m的微孔膜过滤。上机测试分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，计算相关系数。1.4.2色谱分离条件的优化1.4.2.1流动相配比的选择Agilent TC-C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），紫外检测波长210 nm。0.01 mol/L KH2PO4缓冲溶液为水相，甲醇和0.01 mol/L KH2PO4分别为流动相A和B，将流动相 A 和 B 的比例分别设为 199、397、595、1090，流动相使用0.45 m的纤维素膜过滤，超声波脱气。柱温25，流速1.0 mL/min，进样量20 L。根据有机酸分离情况筛选流动相最佳配比。1.4.2.2流速的选择在 1.4.2.1 确定的最佳流动相配比的基础上，使用0.45 m 的纤维素膜过滤流动相，超声波脱气。柱温25，分别设置流速为0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，进样量20 L。根据有机酸分离情况筛选最佳的流速。1.4.2.3柱温的选择在1.4.2.2确定的最佳流速的基础上，分别设置柱温为20、25、30、35，进样量20 L。根据有机酸的分离情况筛选最佳的柱温。1.4.3精密度测定取有机酸混合标准溶液，按照优化后的色谱条件上机检测，连续上样6次，计算变异系数。1.4.4回收率测定取适量试样浸提液，分成4份，其中一份直接上机测定，其余3份中加入不同质量浓度的标准液，按照优化后的色谱条件上机检测，连续 3 次，测定加标回收率5。加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量100%(1)1.4.5试样有机酸测定准确称取新鲜玉米青贮饲料25 g于250 mL具塞三角瓶中，加200 mL超纯水，于恒温振荡箱4、120 r/min振荡 24 h，4 层纱布过滤提取液，快速定量滤纸，0.45 m微孔膜过滤；过滤后的浸提液按照优化后的色谱条件上机测定，每个试验测定5次，具体步骤参照孙蕊等7和王珍珍等8的方法进行。2结果与分析2.1标准曲线绘制与计算（见图1、表1）由图1可知，乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的出峰时间依次为6.194、6.976、13.152、30.016 min。根据各有机酸的峰面积计算有机酸的质量浓度，以有机酸的质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，建立回归方程并计算相关系数。2.2色谱分离条件的优化结果2.2.1流动相配比对高效液相色谱分离效果的影响（见图2、图3）流动相AB为397和595时，有机酸的分离效果与AB为199峰型和出峰时间基本相同。由图2、图3可知，当流动相AB=199时，有机酸出峰较早，丙酸和丁酸分离，仅24 min完成4种有机酸检测；当流动相AB=1090时，有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）分离效果好，峰形对称，峰面积稳定。2.2.2 流 速 对 高 效 液 相 色 谱 分 离 效 果 的 影 响（见图4图6）图1高效液相色谱测定标样中有机酸图谱表1高效液相色谱测定标样中有机酸含量的标准曲线 项目乳酸乙酸丙酸丁酸回归方程y=719.153 5x227.50y=819.294 8x144.33y=794.631 6x756.18y=687.451 2x594.23相关系数（R2）0.994 60.992 40.998 70.995 4图2流动相A B=1 99高效液相色谱图图3流动相A B=10 90高效液相色谱图检测技术NO.02 2023115饲料研究 FEED RESEARCH流速为0.8 mL/min时，有机酸分离效果和检测时间与流速为0.6 mL/min基本相同。由图4图6可知，当流速为0.6 mL/min时，基线漂移，有机酸分离效果不佳，检测时间较长；当流速为1.2 mL/min时，出峰早，乳酸和乙酸分离效果差，检测时间短；流速为 1.0 mL/min时，有机酸出峰时间适宜，分离效果好，峰形对称且稳定。2.2.3 柱 温 对 高 效 液 相 色 谱 分 离 效 果 的 影 响（见图7、图8）柱温为25 时，有机酸的分离效果与柱温为20 时基本相似；柱温为35 有机酸的分离效果与柱温为30 基本相似。由图7、图8可知，柱温为20 时，4种有机酸的出峰时间为5.986、6.132、11.958、32.655 min，乳酸和乙酸的分离效果不佳。随着温度升高，分离效果明显提高，分离时间明显缩短；当柱温为30，4种有机酸出峰时间提早为5.893、5.989、11.486、28.832 min，分离效果好，峰形对称。2.3高效液相色谱测定标样中有机酸含量结果（见表2）由表2可知，4种有机酸测定结果的变异系数为1%3%，表明该测定方法具有较好的精密度，与赵欣等9、许庆方等10研究结论一致。2.4青贮饲料样品有机酸高效液相色谱及回收率测定结果（见图9、表3）由图9、表3可知，青贮饲料中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分别为 2.618、1.569、0.712、0.056 g/L，样品回 收 率 均 在 99.7%102.5%范 围 内，RSD 为 0.16%0.34%，均小于5%。研究表明，该检测体系的稳定性好，可满足 4 种有机酸检测的要求，与王彦平等11、赵艳等12、银燕等13结论一致。图4流速为0.6 mL/min时高效液相色谱图图5流速为1.2 mL/min时高效液相色谱图图6流速为1.0 mL/min时高效液相色谱图图7柱温为20 的高效液相色谱图图8柱温为30 的高效液相色谱图表2高效液相色谱测定标样中有机酸含量结果 单位：g/L序号123456平均值标准偏差变异系数乳酸2.980 62.998 22.948 73.099 42.939 62.941 62.984 70.065 22.18乙酸3.118 83.130 83.125 43.129 93.131 83.115 73.125 40.057 41.84丙酸2.017 92.019 82.038 42.021 21.999 82.048 42.024 30.036 11.78丁酸2.009 92.010 52.099 72.067 92.000 31.999 72.031 30.044 12.17图9青贮饲料样品中有机酸的高效液相色谱图检测技术NO.02 2023116饲料研究 FEED RESEARCH3讨论3.1流动相配比对高效液相色谱分离效果的影响有机相、水相和柱子中的固体相共同作用，使样品能够更好地保存和分离。流动相由极性较大的水和极性较小的有机溶剂按一定比例组成，有机相起洗脱作用，水相使样品延长柱子中的保留时间。本研究表明，随着流动相中甲醇含量增加，有机相比例增大，出峰时间较早，样品检测时间短。原因可能是有机相比例增大，有机酸疏水基与固定相的相互作用减弱，导致分离时间缩短，峰形得到有效改善所致，与傅彤等14、张艳艳等15结论一致。3.2流速对高效液相色谱分离效果的影响流速对出峰时间、峰型和分离效果均会产生不同程度的影响16。本试验发现，随着流速增大，4种有机酸分离效果均出现逐渐改善的情况，检测时间逐渐缩短，峰型逐渐趋于对称稳定；但当流速为1.2 mL/min时，乳酸和乙酸出峰早、分离效果差，与马永强等17、丁明玉等18研究结果一致，表明流速过大对4种有机酸的分离产生不利影响。3.3柱温对高效液相色谱分离效果的影响柱温是影响液相色谱分离的主要因素19。本试验结果表明，随着温度升高，分离效果明显提高，分离时间明显缩短；柱温为30 时分离效果好，检测时间短，峰形对称。原因可能是随着柱温升高，有传质阻力效降低，从而缩短了分离时间，与王珍珍等8研究结果一致。4结论本试验建立了以Agilent TC-C18（250 mm4.6 mm，5 m）为色谱柱，在甲醇和KH2PO4（0.01 mol/L）分别作为流动相A和B（配比为1090），流速为1.0 mL/min，柱温为30 的条件下，测定玉米青贮饲料中的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量的方法，该方法测定青贮饲料中有机酸回收率高，试验变异系数小，分离时间短、分离效果好，分析4种有机酸成分只需约35 min。但本试验中乳酸和乙酸分离效果不太理想，未来需要进一步优化分离条件。参考文献1 张英,周汉林,刘国道,等.利用HPLC法测定王草青贮饲料中的有机酸J.热带作物学报,2013,34(2):377-381.2 贾鹏禹,孙蕊,李井春,等.离子排斥色谱法测定瘤胃液中乳酸和挥发性脂肪酸的含量J.黑龙江畜牧兽医,2017(2):43-46.3 张养东,杨军香,王宗伟,等.青贮饲料理化品质评定研究进展J.中国畜牧杂志,2016,52(12):37-42.4 高晓松.气相色谱法同时快速测定青贮饲料中的挥发性脂肪酸及乳酸J.畜牧与饲料科学,2012,33(8):3-5.5 白杰,李德芳,陈安国,等.HPLC法测定红麻青贮饲料中的有机酸J.中国麻叶科学,2016,38(3):105-109.6 柳俊超,姜俊芳,宋雪梅,等.青贮饲料中主要有机酸的高效液相色谱分离分析J.畜牧与兽医,2015,47(10):47-52.7 孙蕊,贾鹏禹,武瑞,等.高效液相色谱法快速测定青贮饲料中4种有机酸的含量J.饲料研究,2019,42(4):77-79.8 王珍珍,沙如意,王高坚,等.HPLC法同时测定食用植物酵素中12种有机酸J.食品工业科技,2020,41(19):279-286.9 赵欣,武晋海,牛晓峰.基于HPLC法同时测定牛心柿汁中5种有机酸含量J.中国酿造,2022,41(3):232-237.10 许庆方,玉柱,韩建国,等.高效液相色谱法测定紫花苜蓿青贮中的有机酸J.草原与草坪,2007(2):63-65.11 王彦平,刘公言,梁萌,等.高效液相色谱法测定青贮饲料桑中的乳酸、乙酸和丙酸含量条件探讨J.中国饲料,2021(7):97-101.12 赵艳,张凤枰,杨发树,等.高效液相色谱法同时测定饲料添加剂中六种有机酸含量J.中国粮油学报,2015,30(2):127-130.13 银燕,沈尧绅.高效液相色谱法测定果酒中有机酸J.食品与发酵工业,1990(5):44-47.14 傅彤,刁其玉,高腾云,等.青贮饲料中有机酸提取方法的比较研究J.饲料研究,2013,36(5):1-3.15 张艳艳,孙晓康,张晓元,等.高效液相色谱一步法快速测定10种有机酸J.食品与药品,2022,24(1):44-47.16 卢叶,张季,向丽萍,等.HPLC法同时测定赤水晒醋中9种有机酸J.现代食品,2020(13):149-153.17 马永强,邓倩,范洪臣,等.高效液相色谱法测定发酵液中有机酸的优化研究J.中国调味品,2019,44(10):18-25.18 丁明玉,陈培榕,罗国安.食品中有机酸的高效液相色谱分析J.色谱,2017,15(3):212-214.19 王建寰,张霞.高效液相色谱法测定金银花中4种有机酸含量J.宁夏医科大学学报,2013,35(3):350-352.表3高效液相色谱法测定青贮饲料中有机酸含量及回收率结果 项目乳酸乙酸丙酸丁酸样品中含量/(g/L)2.6180.0901.5690.0600.7120.1400.0560.110加标量/(g/L)1.02.03.01.01.52.01.01.52.01.01.52.0加标后测定值/(g/L)3.6430.1104.6290.2905.6880.1402.5690.2503.1020.3103.5770.1601.7280.2202.2110.1702.7340.3201.0530.2401.5620.1902.0710.080样品回收率/%102.5100.6102.3100.0102.2100.4101.699.9101.199.7100.4100.8RSD/%0.280.190.240.160.220.310.290.250.340.180.230.26