益肾达络饮对EAE小鼠乙酰...组蛋白H3的影响及机制探讨_王响.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：王 响（），女（汉族），吉林长春人，长春中医药大学在读博士研究生，硕士学位，主要从事中医药治疗神经免疫疾病的研究工作通讯作者简介：尚晓玲（），女（汉族），吉林长春人，长春中医药大学教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事中医药治疗神经免疫疾病的研究工作益肾达络饮对 小鼠乙酰化组蛋白 的影响及机制探讨王 响，丁文婧，谢名宗，何静文，尚晓玲（长春中医药大学基础医学院，吉林 长春）摘要：目的 探讨益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎（）小鼠乙酰化组蛋白 的影响及机制。方法 只 雌性小鼠随机分成 组：空白组、模型组、中药组、激素组、（受体拮抗剂）组、中药组。分别给予不同药物干预。每日记录各组小鼠的体重及神经功能评分，运用免疫蛋白印迹法（）测定小鼠脑及脊髓中 的表达含量，运用 及免疫组织化学染色法（）检测小鼠脑及脊髓中乙酰化组蛋白 的表达水平。结果 神经功能评分的变化情况：中药组、中药组与激素组低于模型组与 组。各组小鼠中枢神经系统（）中 的表达情况：模型组高于空白组、组、中药组、中药组与激素组。乙酰化组蛋白 的表达情况：模型组高于空白组、中药组、中药组、组与激素组。差异具有统计学意义。结论 益肾达络饮可通过抑制 的表达，降低乙酰化组蛋白 的表达水平，从而降低神经功能评分，缓解 的疾病状态。关键词：多发性硬化；益肾达络饮 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，（），：，：，：；多发性硬化（）主要的病变累及部位是中枢神经系统，是一种自身免疫性脱髓鞘疾病，是青壮年最常见的非外伤性中枢神经系统疾病。目前关于 的发生和进展机制仍未完全阐明，亦无治愈的特效药物。益肾达络饮是高颖教授创制的治疗 的有效方剂，临床上能有效减轻 患者的临床症状和体征，降低复发率，并且可以降低 小鼠的神经功能评分，其机制可能为降低 小鼠血清中炎症因子的水平，调节 小鼠 淋巴细胞亚群比例紊乱、降低 、表达，并对 、信号转导通路有一定抑制作用，但疗效机制仍需进一步研究。本研究旨在探讨益肾达络饮对乙酰化组蛋白 的影响及机制，研究益肾达络饮是否可以通过影响 受体的表达来改变乙酰化组蛋白 的水平，从而影响 小鼠的表观遗传，缓解 小鼠的症状。材料 实实验验动动物物 选用体重 ，周龄的 级 雌性小鼠 只，购于长春亿斯实验动物有限责任公司，生产许可号：（吉）。饲养于长春中医药大学动物实验中心屏障系统内，给予普通饲料、洁净水自由进食。本实验已通过长春中医药大学实验动物伦理委员会审查（批准编号：）。药药物物 益肾达络饮由熟地、制附子、川萆薢、鹿角胶等 味中药共 组成，购自吉林同仁大药房，将饮片放入砂锅中（除外鹿角胶），加入蒸馏水约，浸泡 ，小火煎煮 ，无菌纱布过滤 次，浓缩药液，浓缩过程中加入鹿角胶不断搅拌溶解，最后得浓缩药液，即配置成生药浓度 的中药药液。醋时珍国医国药 年第 卷第 期 酸泼尼松片购自天津天药药业股份有限公司，配制成生药浓度 的药液。试试剂剂 多肽（北京赛百盛，货号：）；百日咳毒素（，货号：）；完全弗氏佐剂（，货号：）；卡介苗佐剂（瑞楚生物，货号：）；（，货号：）；（，货号：）；（）（，货号：）；（）（，货号：）；（）（，货号：）；（，货号：）；发光试剂盒（，货号：）；显色液（，货号：）。方法 动动物物造造模模与与分分组组 随机将 只小鼠平均分为 组，分别为空白组、模型组、组、中药组、中药组、激素组，每组 只。除空白组外，其余组均制备 模型。免疫第 天每只小鼠在背部皮下分四点共注射抗原乳剂（含，灭活结核杆菌，弗氏佐剂，注射前将试剂混合后反复吹打进行乳化，至滴入清水中聚而不散为乳化成功），及 之后每只小鼠腹腔注射百日咳溶液（含百日咳毒素）。免疫第 天 组与 中药组给予 拮抗 受体，按照 进行腹腔注射。免疫第 天开始，模型组、组每天灌胃 生理盐水 ，激素组醋酸泼尼松混悬液 （灌胃前摇匀），其他组益肾达络饮药液 灌胃。体体重重及及神神经经功功能能评评分分 每日观察小鼠一般情况，测量每只小鼠的体重及神经功能评分，采取 分评分法为评分标准，见表。表 分评分法部位临床症状分值无症状尾巴半瘫全瘫无症状四肢肢体力弱 步态改变不完全瘫痪完全瘫痪 尾巴评分与四肢评分相加为小鼠的神经功能评分，死亡记为 分 取取材材 颈椎脱臼后迅速取出新鲜脑及脊髓组织，速冻于液氮中备用于 检测。免疫 后，水合氯醛腹腔注射充分麻醉，固定小鼠，充分剪开胸腔，用生理盐水进行心脏灌注，待流出液体清亮后，改用多聚甲醛溶液灌注，待尾巴与四肢抽搐结束，取出完整的脑及脊髓，多聚甲醛固定，将组织切成 薄片包埋，厚度切片，用于 检测。检检测测脑脑与与脊脊髓髓中中 及及 含含量量 分别提取全脑及全段脊髓的总蛋白，定量，选择浓度为 的分离胶，浓度为的浓缩胶，电泳条件为：，：，：，转膜条件为：，：，：，抗体稀释比例：为：，：，为：，羊抗兔 为：，羊抗鼠 为：，显影，软件进行图片分析。检检测测脑脑及及脊脊髓髓中中乙乙酰酰化化组组蛋蛋白白 含含量量 抗体稀释比例为：，山羊抗兔（二抗）稀释比例为：，显微镜下观察，倍镜下拍照，使用 进行图片分析。统统计计学学方方法法 用 对数据进行分析及绘图，统计各组数据均值及标准差，进行单因素方差分析，具有统计学意义。结果 益益肾肾达达络络饮饮有有效效降降低低 小小鼠鼠神神经经功功能能评评分分 造模后 内 小鼠行为学观察结果见表。空白组无神经功能缺损表现，其余各组小鼠发病时间无统计学差异。最高神经功能评分，与模型组比较，中药组显著降低（），中药组与激素组显著降低（）；与 组比较，中药组评分降低（），中药组与激素组显著降低（）。第 天的评分情况，与模型组比较，中药组明显降低（），中药组显著降低（），激素组显著降低（）；与 组比较，中药组评分降低（），组明显降低（），激素组显著降低（）。表 各组小鼠神经功能评分比较（?）组别平均发病时间 平均最高分第 天评分第 天小鼠数量空白组 模型组 组 中药组 中药组 激素组 与模型组比较，。与 组比较，；益益肾肾达达络络饮饮抑抑制制 小小鼠鼠体体内内 的的表表达达 如图 及表所示，脑组织中，与空白组比较，模型组 的表达量明显增多（），与模型组比较，中药组、中药组、激素组 表达量明显降低（），与模型组比较，组表达量显著降低（）；脊髓组织中，与空白组比较，模型组 的表达量显著增多（），与模型组比较，组、中药组、中药组、激素组 表达量明显降低（）。益益肾肾达达络络饮饮通通过过抑抑制制 受受体体从从而而促促进进乙乙酰酰化化 的的表表达达水水平平 检检测测各各组组小小鼠鼠脑脑与与脊脊髓髓组组织织中中乙乙酰酰化化 的的表表达达水水平平 如图 及表 所示，脑组织中，与空白组比较，模型组 的表达量明显增加（）；与模型组比较，中药组 表达量下降（），组与激素组明显降低（），中药组显著降低（）。脊髓组织中，与空白组比较，中药组明显升高（），组显著升高（），模型组显著升高（）；与模型组比较，其他组别显著降低（）；与 组比较，中药组显著降低（），激素组显著降低（）；与中药组比较，中药组明显降低（），激素组显著降低（）。检检测测各各组组小小鼠鼠脑脑及及脊脊髓髓组组织织中中 的的表表达达水水平平 如图 及表 所示，脑组织中，与空白组比较，模型组 表达量明显增加（）；与模型组比较，组明显降低（），中药组显著降低（），中药组与激素组显著降低（）；与 组比较，中药组表达量降低（）。脊髓组织中，与空白组比较，模型组 表达量明显增加（）；与模型组比较，中药组降低（），中药组明显降低（），激素组显著降低（）。空白组；模型组；组 中药组；中药组；激素组 时珍国医国药 年第 卷第 期与空白组比较，；与模型组比较，图 各组小鼠脑组织及脊髓组织 的表达图像及数据表 各组小鼠脑组织及脊髓组织 的表达数据（?）组别脑组织脊髓组织空白组 模型组 组 中药组 中药组 激素组 与空白组比较，；与模型组比较，；讨论 是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病。其具体发病机制尚不完全清晰，近些年来研究发现，个体除受到先天遗传因素影响外，甲基化、组蛋白修饰、微小（）以及染色质重塑等表观遗传学机制很有可能也参与了 疾病免疫调节，炎症反应以及少突胶质细胞的分化调节，其中组蛋白修饰是表观遗传机制中研究较多的。在啮齿类动物模型中，组蛋白的去乙酰化促进少突胶质细胞的分化，与之相反，组蛋白的乙酰化抑制其分化。患者的脑白质中存在组蛋白乙酰化的偏移。启动子区域的高乙酰化能使抑制少突胶质细胞分化的转录因子产生增多。并且组蛋白乙酰化可以促进促炎症基因的表达，导致炎性因子分泌增加，选择性敲除小鼠组蛋白去乙酰化酶（，）和 基因后，小鼠表现出严重的低髓鞘状态。作为第一个被克隆出来的 受体，由于其分布广泛，在参与对抗炎症、促进神经元和神经纤维细胞生长等生理调节方面，发挥了决定性的作用。受体拮抗剂 可以抑制激动剂诱导的增殖反应，阻滞 受体可以抑制缺血损伤所导致的星形胶质细胞增殖。所以 作为治疗神经性疾病的靶点，越来越受到人们的重视。空白组；模型组；组 中药组；中药组；激素组与空白组比较，；与模型组比较，；与 组相比，；与中药组比较，图 各组小鼠脑组织及脊髓组织 的表达图像及数据表 各组小鼠脑组织及脊髓组织 的表达数据（?）组别脑组织脊髓组织空白组 模型组 组 中药组 中药组 激素组 与空白组比较，；与模型组比较，；与 组相比，；与中药组比较，；时珍国医国药 年第 卷第 期 空白组；模型组；组 中药组；中药组；激素组与空白组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组小鼠脑组织及脊髓组织 的表达图像及数据表 各组小鼠脑组织及脊髓组织 的表达数据（?）组别脑组织脊髓组织空白组 模型组 组 中药组 中药组 激素组 与空白组比较，；与模型组比较 ，；与 组比较，；实验结果发现各组小鼠发病时间无统计学差异，说明预防性给予中药、激素以及拮抗 受体并不能阻止 的发生。但是抑制 受体的表达及给予益肾达络饮治疗之后可以有效降低神经功能评分，说明中药很有可能对 受体产生了影响。进一步研究发现，成功抑制了小鼠 中 的表达，而益肾达络饮与激素同样抑制了 的表达，在给予 的基础之上再进行中药干预发现 的含量得到了进一步的降低，说明益肾达络饮可以抑制 小鼠 中 的表达。通过测定 中乙酰化组蛋白 的含量发现，小鼠体内乙酰化 的含量是升高的，益肾达络饮可以有效降低 的乙酰化水平，而阻滞 受体同样降低了乙酰化 的含量，说明，中药可能通过抑制 受体的表达，从而减少了 中乙酰化 的含量，影响 小鼠的表观遗传修饰，从而治疗。本研究虽然提示益肾达络饮可以改变 小鼠的表观遗传修饰、影响膜受体的活性，但是其详细治疗机制尚需进一步的实验研究。参考文献：胡学强 多发性硬化 北京：人民卫生出版社，尚晓玲，高 颖，尹 岭，等 益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎 的影响 天津中医药，（）：朱文浩，高 颖，关东升，等 益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经功能评分和病理特征的影响 辽宁中医杂志，（）：朱文浩，赖新星，高 颖，等 益肾达络饮对实验性自身免疫脑脊髓炎 、的影响 中医学报，（）：尚晓玲，高 颖，尹 岭，等 益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠 的影响 中医药临床杂志，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，：时珍国医国药 年第 卷第 期