盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片氨基酸代谢过程的影响_刘建新.pdf

第 32 卷第 2 期Vol.32，No.2119-1302023 年 2 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA刘建新，刘瑞瑞，刘秀丽，等.盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片氨基酸代谢过程的影响.草业学报，2023，32（2）：119130.LIU Jian-xin，LIU Rui-rui，LIU Xiu-li，et al.Effects of exogenous hydrogen sulfide on amino acid metabolism in naked oat leaves under saline-alkalistress.Acta Prataculturae Sinica，2023，32（2）：119130.盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片氨基酸代谢过程的影响刘建新*，刘瑞瑞，刘秀丽，欧晓彬，贾海燕，卜婷，李娜（甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室，陇东学院生命科学与技术学院，甘肃 庆阳 745000）摘要：信号硫化氢缓解植物盐碱胁迫机理备受关注。为探讨外源硫化氢对盐碱胁迫下植物氨基酸代谢的调控机制，采用盆栽土培试验，以裸燕麦品种 定莜 9号 为材料，设置盆土不添加盐碱和添加 3.00 g kg-1盐碱（摩尔比 NaCl Na2SO4Na2CO3NaHCO3=12819）与抽穗期叶面喷蒸馏水和喷 50 mol L1硫化氢供体硫氢化钠（NaHS）溶液，共 4个处理。研究其对叶片中总氨基酸、丙二醛含量和籽粒产量的影响；运用液相色谱和质谱检测，采用主成分分析 22种组成蛋白质的氨基酸中差异氨基酸，解析外源硫化氢对氨基酸代谢途径的调控效应。结果表明：在裸燕麦叶片中未检出高半胱氨酸。喷施 NaHS 溶液对盐碱胁迫下裸燕麦叶片中总氨基酸含量下降的缓解效应不显著，对盐碱胁迫诱导的丙二醛含量的升高和籽粒产量的下降有显著的缓解作用。主成分分析结果显示：盐碱胁迫下，喷施 NaHS 可显著下调裸燕麦叶片中-酮戊二酸族的鸟氨酸和草酰乙酸族的天冬酰胺含量；显著上调-酮戊二酸族的谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸和丙酮酸族的亮氨酸及芳香族的酪氨酸含量，对甘氨酸、丝氨酸（3-磷酸甘油酸族）、色氨酸、苯丙氨酸（芳香族）、丙氨酸、缬氨酸（丙酮酸族）、-氨基丁酸、组氨酸、谷氨酸（-酮戊二酸族）、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、天冬氨酸（草酰乙酸族）含量无显著影响。表明外源硫化氢参与盐碱胁迫下裸燕麦氨基酸代谢途径的调控，它能够缓解盐碱胁迫造成的氧化伤害和同化物积累抑制。关键词：盐碱胁迫；硫化氢；裸燕麦；氨基酸代谢Effects of exogenous hydrogen sulfide on amino acid metabolism in naked oatleaves under saline-alkali stressLIU Jian-xin*，LIU Rui-rui，LIU Xiu-li，OU Xiao-bin，JIA Hai-yan，BU Ting，LI NaGansu Key Laboratory of Protection and Utilization for Biological Resources and Ecological Restoration，College of Life Sciences andTechnology，Longdong University，Qingyang 745000，ChinaAbstract：The mechanism where by hydrogen sulfide alleviates saline-alkali stress in plants has attracted muchattention.This experiment investigated the mechanisms underlying exogenous hydrogen sulfide effects on the aminoacid metabolism of plants under saline-alkali stress in potted plants of the naked oat varietyDingyou 9grown insoil.There were four treatments：a 22 factorial combination of no saline-alkali or 3.00 g kg1saline-alkali（molarratio NaCl Na2SO4Na2CO3NaHCO3=12 8 1 9）added to the soil in the pot，and the leaves were sprayed withdistilled water or 50 mol L1sodium hydrosulfide（a hydrogen sulfide donor，NaHS）solution at the heading stage.Effects of exogenous hydrogen sulfide on the total amino acid and malondialdehyde contents in leaves and on the grainDOI：10.11686/cyxb2022044http：/收稿日期：2022-01-22；改回日期：2022-03-09基金项目：国家自然科学基金（31960375；31860114）和甘肃省自然科学基金（20JR5RA491；20JR5RA486）资助。作者简介：刘建新（1964-），男，甘肃通渭人，本科，教授。E-mail： 通信作者 Corresponding author.E-mail：Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）yield of naked oats under the four treatments were studied.Liquid chromatography and mass spectrometry were usedfor chemical analysis，and data were analyzed by principal component analysis of levels of the 22 amino acids thatmake up the protein，in order to determine the regulatory effect of exogenous hydrogen sulfide on amino acidmetabolic pathways.It was found that：homocysteine was not detected in the leaves of naked oat.There was nosignificant decrease in total amino acid content in naked oat leaves under saline-alkali stress as a result of sprayingNaHS，but NaHS significantly alleviated the increase in malondialdehyde content in leaves and the decrease in grainyield induced by saline-alkali stress.The results of principal component analysis showed that under saline-alkalistress，spraying NaHS solution significantly down-regulated the contents of ornithine（-ketoglutarate family）andasparagine（oxaloacetate family），and significantly up-regulated the contents of glutamine，proline，arginine（-ketoglutarate family），leucine（pyruvate family），and tyrosine（aromatic family）in leaves，but had no significanteffect on the contents of glycine，serine（3-phosphoglycerate family），tryptophan，phenylalanine acid（aromaticfamily），alanine，valine（pyruvate family），4-aminobutyric acid，histidine，glutamic acid（-ketoglutarate family），isoleucine，threonine，methionine，lysine and aspartic acid（oxaloacetic acid family）.The above results indicate thatexogenous hydrogen sulfide is involved in the regulation of amino acid metabolic pathways in naked oat under saline-alkali stress，and that NaHS can alleviate the oxidative damage and inhibition of assimilate accumulation caused bysaline-alkali stress.Key words：saline-alkali stress；hydrogen sulfide；naked oats；amino acid metabolism土壤盐渍化是限制农业发展和威胁生态安全的世界性环境问题1。我国内陆地区的盐碱地主要为盐（NaCl、Na2SO4）碱（NaHCO3、Na2CO3）复合类型2。植物遭受盐碱复合胁迫时在渗透胁迫和营养失衡基础上协同叠加高pH 胁迫，对植物造成的伤害远大于单一盐胁迫或碱胁迫3。目前，有关植物抗盐碱机制的探究多集中在盐胁迫方面，对碱胁迫和盐碱复合胁迫涉及相对较少。盐碱复合胁迫下，植物会重构体内碳氮代谢平衡，使碳代谢向氮代谢偏移，积累更多如脯氨酸、游离氨基酸等含氮有机物来加强渗透调节，以增强盐碱适应能力4-5。研究表明，植物氨基酸代谢积累与其耐盐性密切相关6。盐胁迫下，植物叶片中重要氨基酸显著积累7，参与渗透调节、活性氧清除和离子运输，缓解盐胁迫对叶肉细胞的生理伤害8-9。碱胁迫强烈影响水稻（Oryza sativa）氨基酸的代谢10，且氨基酸代谢的独特调节与小麦（Triticum aestivum）品种对短暂干旱的耐受性增强有关11。目前，有关植物氨基酸代谢对盐碱复合胁迫的响应及外源信号对其响应的调节效应仍尚不清楚。植物气体信号硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）参与许多生理过程调控，能够增强植物对非生物胁迫的抗性12。研究表明，盐胁迫下，H2S可抑制紫花苜蓿（Medicago sativa）细胞钾离子外流13；维持水稻矿质离子平衡13和降低大麦（Hordeum vulgare）钠钾比14；提高茶树（Camellia sinensis）15和玉米（Zea mays）16活性氧清除能力。外源 H2S参与盐碱胁迫下植物可溶性蛋白质、游离氨基酸和脯氨酸代谢调控4,17，且随 H2S浓度和处理时间4及植物生育期不同18对可溶性蛋白质、游离氨基酸和脯氨酸代谢存在正负调控。裸燕麦（Avena nuda）是我国北方和西部地区种植的禾本科燕麦属粮饲兼用型作物19，其籽粒含有高于常见禾谷类作物的蛋白质和不饱和脂肪酸，并富含膳食纤维-葡聚糖和燕麦黄酮，具有丰富营养和降低血清胆固醇的作用，成为美国食品和药物管理局批准的第一个“具有降低心脏病风险”的谷物保健食品20。甘肃省中部地区是我国裸燕麦的主产区之一，裸燕麦也是当地农民增收和改善膳食结构的重要杂粮，但西部土壤的盐碱化严重影响裸燕麦的生长发育和产量提高。本试验采用盆栽土培试验，模拟甘肃省中部土壤盐碱含量和组成，研究喷施 H2S供体硫氢化钠（NaHS）对盐碱复合胁迫下裸燕麦氨基酸代谢过程的调控效应，以期揭示 H2S增强植物耐盐碱性的生理机制，为探索利用 H2S缓解植物盐碱胁迫伤害提供理论依据。1材料与方法1.1供试材料裸燕麦品种 定莜 9 号 种子购自甘肃省定西市农业科学研究院；NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3、NaHS 购120第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年自上海生工生物工程股份有限公司；复合肥从甘肃省庆阳市田田圈农化有限公司购买。1.2材料培养盆栽土培试验于 2021 年 4-8 月在甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室生物科技园进行。供试土壤取自陇东黄土高原（10741 4 E，3543 50 N）黑垆土耕作层（020 cm），砂壤土质地。将土样风干、过 3 mm 筛，备用。土壤基本性状：有机质 11.83 g kg1，速效氮 37.4 mg kg1，速效磷（P2O5）7.25 mg kg1，速效钾（K2O）182.5 mg kg1，水溶性总盐含量 0.773 g kg1，pH 7.92。试验用塑料盆口径 31.5 cm，高 34.0 cm，配底托。过筛土样分两组：一组中不添加中性盐（NaCl、Na2SO4）和碱性盐（NaHCO3、Na2CO3）；另一组模拟甘肃省中部土壤盐碱含量和组成添加质量分数为 3.00 g kg-1（包括土壤盐碱背景值）的中性盐和碱性盐（摩尔比 NaCl Na2SO4Na2CO3NaHCO3=12 8 1 9）。两组土样中均按 0.5 g kg1（土）加入氮-磷-钾（13-17-15）复合肥和0.269 L kg1（土）有机草碳基质以供给养分和防土壤板结，各自充分拌匀后装盆，每盆装土 22.0 kg。每盆浇 5.0L 自来水至田间持水量 75%左右，沉实 3 d 后播种（4 月 6 日），种子用质量分数为 0.2%的 50%多菌灵粉剂拌种12 h以预防裸燕麦黑穗病。每盆播种大约 60粒种子，播后覆土 23 cm，常规管理。5月 9日定苗，每盆保留一致壮苗 25株。裸燕麦生长至 6月 18日抽穗期（前期试验确定的最佳喷施时期）时进行喷施处理。1.3试验设计试验设置 4个处理：1）以盆土中不添加中性盐和碱性盐，叶面喷施蒸馏水作为对照（CK）；2）以盆土中添加中性盐和碱性盐，叶面喷施蒸馏水作为盐碱胁迫处理（salt-alkali stress，SA）；3）以盆土中添加中性盐和碱性盐，叶面喷施 50 mol L-1NaHS 溶液作为盐碱胁迫下喷施 H2S 处理（SA+NaHS）；4）以盆土中不添加中性盐和碱性盐，叶面喷施 50 mol L1NaHS溶液作为单一 H2S处理（NaHS）。每处理 6盆（3盆用作氨基酸等指标检测取样，另 3盆用于成熟后籽粒产量统计），4次重复，复拉丁方设计排布，共 192盆。用手持压缩式喷雾器（成都市鑫桂塑胶有限公司）每天早晚叶面各喷施一次，连续喷施 3 d。为提高喷施液与叶面的黏附性，喷施液中添加体积分数为 0.01%的 Tween-80，每盆喷施量 150 mL左右。喷施结束后第 7天剪取植株倒数第 2片叶，用吸水纸擦拭干净，装入冻存管置液氮速冻后，一部分转移至70 超低温冰箱保存，用于总游离氨基酸和丙二醛含量测定；另一部分用干冰包埋、打包邮寄至苏州帕诺米克生物医药科技有限公司检测氨基酸含量。7月 20日裸燕麦成熟后收获测定籽粒产量。1.4测定项目与方法采用茚三酮显色法测定总游离氨基酸含量21；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法测定21。22种氨基酸组分 含 量 委 托 苏 州 帕 诺 米 克 生 物 医 药 科 技 有 限 公 司 用 美 国 产 Waters 品 牌 UPLC 型 液 相 色 谱（liquidchromatography，LC）仪和 Ab Sciex品牌 AB5000型质谱（mass spectrometry，MS）仪检测。7月 20日裸燕麦成熟后收获，脱粒、除杂风干后用千分之一精度天平称量每盆籽粒的重量。1.5数据处理采用 Microsoft Excel 2016整理数据，运用 SPSS 20.0软件进行一般线性模型单变量无交互拉丁方设计多因素方差分析，邓肯法多重比较（显著水平为 0.05）。用 Simca 14.1软件对氨基酸组分含量进行等方差缩放后偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和隐结构正交投影判别分析（orthogonalprojection to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA），筛选差异氨基酸。2结果与分析2.1盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片总游离氨基酸含量的影响与 CK 相比，SA 处理使裸燕麦叶片总游离氨基酸含量下降了 13.94%（图 1），差异显著。与 SA 处理相比，SA+NaHS处理的总游离氨基酸含量提高了 5.02%，差异不显著。与 CK 相比，单独 NaHS处理的总游离氨基酸含量下降了 2.18%，差异不显著。121Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）2.2不同处理下裸燕麦叶片氨基酸含量的变化轨迹利用 LC-MS 检测出裸燕麦叶片中共 21 种氨基酸，其含量差异颇大（表 1）。不同处理下的裸燕麦叶片中 Gln、Lys、GABA、Ala和 Leu 5种氨基酸的含量较高，置 信 区 间 在 187.562607.63 g g1FW 之 间；Ser、Val、Thr、Asp、Phe、Arg 和 Tyr 7 种氨基酸含量次高，置信区间在 65.348167.93 g g1FW 之间；Gly、Pro、Ile、Asn、Met、His 和 Trp 7 种氨基酸的含量中等，置信区间在 10.285167.935 g g1FW 之间；Orn 和Glu 2 种氨基酸的含量较低，置信区间分别为 0.3031.565 g g1FW 和 1.09412.342 g g1FW。运用差异倍数（fold change，FC）表示初始值至最终值的变化程度，取差异倍数的对数值反映差异变化的相对大小。以 CK为初始值，log2FC是正值表示上调，负值表示下调。从表 1可见，与 CK相比，SA 处理下裸燕麦叶片中只有 Orn 和 Arg 上调，其他 19 种氨基酸均下 调。与 SA 处 理 相 比，SA+NaHS 处 理 下 Gly、GABA、Pro、Ile、Leu、Gln、Lys、Glu、Met、Phe、Arg、Tyr、Trp 13种氨基酸上调，Ala、Ser、Val、Thr、Asn、Orn、Asp、His 8种氨基酸下调。与 CK 相比，单独 NaHS 处理下 GABA、Ser、Asp、His、Trp、Arg、Phe 7种氨基酸上调，Gly、Ala、Pro、Val、Thr、Ile、Leu、Asn、Orn、Gln、Lys、Glu、Met、Tyr 14种氨基酸下调。表明外源硫化氢正负调控正常和盐碱胁迫下裸燕麦不同氨基酸积累。2.3盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片不同合成途径氨基酸组成的显著性分析为明确盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦不同氨基酸积累的显著影响，进一步分析了 3-磷酸甘油酸（Gly、Ser）、-酮戊二酸（Orn、Glu、Gln、Pro、Arg、His、GABA）、丙酮酸（Ala、Val、Leu）、芳香族（Phe、Tyr、Try）和草酰乙酸（Asp、Asn、Met、Thr、Lys、Ile）合成途径中氨基酸含量的变化。由图 2 可知，与 CK 相比，SA 处理显著降低了Gly、Ser、Glu、Pro、GABA、Ala、Val、Tyr、Asn、Thr、Ile 含量，显著提高了 Arg 含量，而 Orn、Gln、His、Leu、Phe、Trp、Asp、Met、Lys含量的变化不显著。与 SA 处理相比，SA+NaHS处理显著提高了 Gln、Arg含量，降低了 Orn、Asn 含量，Gly、Ser、Glu、Pro、His、GABA、Ala、Val、Leu、Phe、Tyr、Trp、Asp、Met、Thr、Lys、Ile 含量变化不显著。与 CK 相比，单独 NaHS处理显著提高了 Arg、Asp含量，降低了 Gly、Orn、Glu、Gln、Val、Asn、Ile含量，而 Ser、Pro、His、GABA、Ala、Leu、Phe、Tyr、Trp、Met、Thr、Lys含量无显著变化。2.4盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片氨基酸组成的主成分分析主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种通过多元线性组合提取尽可能多的原始数据信息综合变量的无监督降维统计分析方法22。经 PCA 分析观察裸燕麦叶片氨基酸含量的变化（图 3），分析结果拟合 3个主成分，解释模型差异的决定系数 R2X=0.751，预测模型差异的拟合优度 Q2=0.535，R2XQ2=0.2160.3，说明模型拟合效果较好。从图 3A 可以看出：不同处理裸燕麦叶片氨基酸组成存在明显差异，CK、NaHS 处理与SA、SA+NaHS处理在第一主成分（PC1）上区分开来，SA 与 SA+NaHS处理在第二主成分（PC2）上相区别。另外，SA 处理点相对聚集，说明 SA 处理组内样品氨基酸含量差异较小；而 CK、NaHS和 SA+NaHS 处理点相对分散，说明组内样品之间氨基酸含量差异较大。从得分图与载荷图（图 3B）、双标图（图 3C）结合分析可知，SA+NaHS 处理的 Arg、Gln 含量非常高，而 Asp、Glu、Asn、Ser、Thr、Ala、Gly、Ile、GABA 含量较低；CK 则正好相反；SA 处理的 Phe、Lys、Met、Leu、Trp、Tyr、His、Pro 等含量很低，单独 NaHS 处理的这些氨基酸含量则较高。上述结果说明，不同处理使裸燕麦叶片氨基酸含量发生显著改变。图 1盐碱胁迫下外源 H2S对裸燕麦叶片总氨基酸含量的影响Fig.1Effects of exogenous hydrogen sulfide on total aminoacid content in naked oat leaves under salt-alkali stressCK：无盐碱胁迫下喷水对照；SA：盐碱胁迫下喷水；SA+NaHS：盐碱胁迫下喷施 NaHS；NaHS：无盐碱胁迫下喷施 NaHS。数值为 8次重复的平均值标准差，不同字母表示差异显著（P0.05）。下同。CK：Control of spraying water under no salt-alkali stress；SA：Spraing waterunder salt-alkali stress；SA+NaHS：Spraying NaHS under salt-alkalistress；NaHS：Spraying NaHS under no salt-alkali stress.Values weremeansstandarddeviationsofeightindependentreplications.Thedifferent letters indicate significant differences among the treatments atP1 且方差分析 P1且 95%置信区间不包括零筛选并结合 S-图解析可知：与 CK 相比，SA 处理下含量显著上调的差异氨基酸是 Arg，显著下调的氨基酸有 10 种，依次是 Glu、Thr、Ser、Gly、Leu、Ile、Ala、Val、Tyr、Asn（图 5B）；与 SA 处理相比，SA+NaHS 处理 Orn、Asn含量显著下调，Gln、Tyr、Arg、Leu、Pro含量显著上图 2盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片中 3-磷酸甘油酸、-酮戊二酸、丙酮酸、芳香族和草酰乙酸途径氨基酸含量的影响Fig.2Effects of exogenous hydrogen sulfide on the content of individual amino acids in the 3-phosphoglycerate，-ketoglutarate，pyruvate，aromatic，and oxaloacetate pathways in naked oat leaves under saline-alkali stress124第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年调（图 5D）；与 CK 相 比，NaHS 处 理 Arg、Asp 含 量 显 著 上 调，而 Glu、Orn、Gly、Thr、Gln、Ile 含 量 显 著 下 调（图 5E）。2.7盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片丙二醛含量和籽粒产量的影响细胞膜脂氧化产物丙二醛含量的大小反映细胞膜氧化损伤的程度，产量高低是作物适应盐碱环境能力的直接反映3，18。从图 6可知：与 CK 相比，SA 处理显著提高了裸燕麦叶片丙二醛含量 33.01%，而籽粒产量显著下降了 43.56%；SA+NaHS 处理与 SA 处理相比丙二醛含量显著下降了 27.00%，籽粒产量显著提高了 52.83%；单独 NaHS 处理的丙二醛含量和籽粒产量与 CK 差异不显著。表明外源硫化氢能够缓解盐碱胁迫诱导的裸燕麦氧化损伤和同化物积累抑制。3讨论植物体游离氨基酸参与细胞离子运输、酶促反应和渗透调节，其代谢积累与植物盐碱耐性密切关联6，22-23。盐胁迫导致花棒（Hedysarum scoparium）叶片总游离氨基酸含量显著升高7，碱胁迫引起小麦24和水稻10叶片总游离氨基酸含量显著减少。本试验结果表明，盐碱复合胁迫造成裸燕麦叶片总游离氨基酸含量显著下降（图 1），其原因可能主要是高 pH 胁迫抑制氮的吸收25。外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片总游离氨基酸含量下降的图 3不同处理下裸燕麦叶片氨基酸含量的主成分分析得分图（A）、载荷图（B）和双标图（C）Fig.3Principal component analysis scores plot（A），loading plot（B），and biplot（C）of amino acid content in naked oat leavesunder different treatmentsGly：甘氨酸 L-Glycine；Ala：丙氨酸 L-Alanine；GABA：-氨基丁酸 4-Aminobutyric acid；Ser：丝氨酸 L-Serine；Pro：脯氨酸 L-Proline；Val：缬氨酸 L-Valine；Thr：苏氨酸 L-Threonine；Ile：异亮氨酸 L-Isoleucine；Leu：亮氨酸 L-Leucine；Asn：天冬酰胺 L-Asparagine；Orn：鸟氨酸盐酸盐 L-Ornithine hydrochloride；Asp：天冬氨酸 L-Aspartic acid；Hcy：高半胱氨酸 DL-Homocysteine；Gln：谷氨酰胺 L-Glutamine；Lys：赖氨酸 L-Lysine；Glu：谷氨酸 L-Glutamic acid；Met：甲硫氨酸 L-Methionine；His：组氨酸 L-Histidine；Phe：苯丙氨酸 L-Phenylalanine；Arg：精氨酸 L-Arginine；Tyr：酪氨酸 L-Tyrosine；Trp：色氨酸 L-Tryptophan.下同 The same below.图 4不同处理下裸燕麦叶片氨基酸 PLS-DA得分图及 200次模型的置换检验Fig.4PLS-DA score plot of naked oat leaves under different treatment and 200 permutation test of the modelt1：第一预测主成分 First predictor principal component.t2：第二预测主成分 Second predictive principal component.125Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）图 5不同处理下裸燕麦叶片氨基酸含量 OPLS-DA得分图（A、C、E）和 S形图（B、D、F）Fig.5OPLS-DA score plot（A，C，E）and S-plot（B，D，F）of amino acid contents in naked oat leaves under differenttreatmentA，B：CK vs.SA；C，D：SA vs.SA+NaHS；E，F：CK vs.NaHS.图 6盐碱胁迫下外源硫化氢对裸燕麦叶片丙二醛含量和籽粒产量的影响Fig.6Effects of exogenous hydrogen sulfide on malondialdehyde content in leaves and grain yield of naked oat under salt-alkalistress126第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年缓解效应没有统计学意义（图 1），但它显著正负调控盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片不同氨基酸的积累（图 2）。表明外源硫化氢参与盐碱胁迫下裸燕麦氨基酸代谢的调控。Aidoo等11研究表明，氨基酸代谢的独特调节与植物耐逆性增强有关。本研究结果显示，外源硫化氢能够显著减轻盐碱复合胁迫诱导的裸燕麦叶片丙二醛含量的升高（图 6A），并有效消减盐碱复合胁迫造成的裸燕麦籽粒产量的下降程度（图 6B）。这与外源硫化氢可有效缓解盐胁迫对青钱柳（Cyclocarya paliurus）26、小麦27和碱胁迫对水稻28等生长抑制的结果一致。由此推测，外源硫化氢对氨基酸代谢过程的调控可能是其增强裸燕麦耐受盐碱胁迫能力的重要机制之一。植物氨基酸的组成和积累水平对其适应逆境至关重要24。本试验发现，裸燕麦叶片中氨基酸含量相差巨大，检出的 21 种氨基酸中谷氨酰胺、赖氨酸、-氨基丁酸、丙氨酸和亮氨酸的含量较高（置信区间 187.562607.63g g1FW），鸟氨酸和谷氨酸的含量较低（置信区间 0.30312.342 g g1FW）（表 1）。与对照比较，其他 3 个处理的裸燕麦叶片中氨基酸 log2FC为2.7281.182（表 1）。说明环境因素对裸燕麦氨基酸存在较大影响。方差分析显示，盐碱复合处理显著降低了裸燕麦叶片甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、-氨基丁酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸含量，却显著提高了精氨酸含量（图 2）。这与燕辉等7的盐胁迫显著提高花棒叶片脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸含量的结果不同，也与 Wu等10的碱胁迫显著降低水稻叶片精氨酸含量和提高丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量的结果相反。这可能与植物种类、胁迫类型、强度和时间等有关。目前，外源硫化氢图 7OPLS-DA分析提出盐碱胁迫下外源硫化氢调控裸燕麦叶片氨基酸代谢途径Fig.7Exogenous hydrogen sulfide regulates amino acid metabolism pathways in naked oat leaves under saline-alkali stressobtained from OPLS-DA analysis127Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）对盐碱胁迫下植物氨基酸代谢的调控未见报道。本试验发现，外源硫化氢显著提高盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片谷氨酰胺和精氨酸含量，却显著降低鸟氨酸和天冬酰胺含量（图 2）。说明外源硫化氢参与盐碱胁迫下裸燕麦氨基酸积累的调控。这可能与硫化氢能够诱导盐碱胁迫下植物氨基酸代谢相关蛋白表达有关29。盐碱胁迫下，植物往往通过氨基酸代谢途径的改变使一些氨基酸大量积累7，24，从而参与细胞渗透调节和自由基清除8-9，维持功能蛋白和代谢酶的稳定性30。组成植物蛋白质和酶的氨基酸从合成碳架来源可分成 3-磷酸甘油酸、-酮戊二酸、丙酮酸、草酰乙酸和芳香族 5大类31。PCA 分析结果表明，盐碱胁迫或外施硫化氢使裸燕麦叶片不同氨基酸含量发生显著改变（图 3）。PLS-DA（图 4）和 OPLS-DA（图 5）分析可将不同处理间裸燕麦含量差异的氨基酸进行高效区分：盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片中-酮戊二酸族的精氨酸含量显著上调；含量显著下调的是-酮戊二酸族的谷氨酸，草酰乙酸族的苏氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸，3-磷酸甘油酸族的丝氨酸、甘氨酸，丙酮酸族的亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸，芳香族的酪氨酸（图 5和图 7）。精氨酸是一种氮碳比最高的氨基酸，除作为蛋白质组成外，还是一氧化氮、多胺和脯氨酸等生物合成的前体32。精氨酸在裸燕麦叶片中的大量积累，能够提高细胞亚精胺含量，减轻自由基氧化损伤33，从而有效增强裸燕麦适应盐碱胁迫的能力。以糖酵解途径和三羧酸循环中间物为合成前体的 5大族氨基酸含量的显著下调充分说明盐碱胁迫导致裸燕麦碳氮代谢发生紊乱。外施硫化氢可正负调控正常条件或盐碱复合胁迫下裸燕麦中不同途径氨基酸的代谢（图 7）。盐碱复合胁迫下，外源硫化氢显著下调了裸燕麦叶片中-酮戊二酸族的鸟氨酸和草酰乙酸族的天冬酰胺含量（图 5D和图 7），原因可能是硫化氢促使天冬酰胺脱氨产生天冬氨酸，天冬氨酸通过三羧酸循环转换为谷氨酸和谷氨酰胺34。外源硫化氢显著上调盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片中-酮戊二酸族的谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸和丙酮酸族的亮氨酸及芳香族的酪氨酸含量，对 3-磷酸甘油酸族的氨基酸影响不大（图 5D 和图 7）。精氨酸和鸟氨酸同是尿素循环中重要的中间物，鸟氨酸又是脯氨酸的合成前体。外源硫化氢可能通过加速尿素循环促进鸟氨酸转化成精氨酸，同时又激活鸟氨酸途径合成脯氨酸5，或抑制鸟氨酸合成酶表达29，从而使鸟氨酸含量显著下降而精氨酸和脯氨酸含量显著上调。脯氨酸是一种高溶解度、富含氮和能量的中性氨基酸7。脯氨酸在裸燕麦叶片中的积累，在不引起细胞酸碱度改变的同时，能够降低细胞渗透势、清除活性氧、稳定蛋白质和亚细胞结构、维持氧化还原平衡35，从而有效缓解盐碱胁迫对叶肉细胞的伤害。植物体通常还会把盐胁迫产生的过量氨转化成谷氨酸/谷氨酰胺，或通过谷氨酸脱氢酶转化为-酮戊二酸进入三羧酸循环36。外源硫化氢可能既促进氨与-酮戊二酸生成谷氨酸，又促进谷氨酸转化生成谷氨酰胺，从而保持稳定的谷氨酸水平，提高谷氨酰胺含量，防止氨毒发生。盐碱复合胁迫下，喷施硫化氢使裸燕麦叶片亮氨酸积累表明硫化氢可能加强了裸燕麦呼吸作用，呼吸中糖酵解终产物丙酮酸通过转氨基作用生成丙氨酸，进一步合成了亮氨酸，但具体机制尚待证实。芳香族氨基酸的合成需要以糖酵解途径中的磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途径产生的 4-磷酸赤藓糖为底物经过莽草酸途径合成莽草酸，进而合成分支酸后转化生成色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸37。外源硫化氢对盐碱复合胁迫下裸燕麦酪氨酸含量的显著上调表明其可能参与磷酸戊糖途径、糖酵解和莽草酸途径的协调调节，其原因也许与硫化氢能够提高盐碱胁迫下植物分支酸合成途径相关酶蛋白表达有关29。然而，硫化氢对植物碳氮代谢协调调控的机制交叉复杂，尚需利用分子生物学等手段深入解析其缓解植物盐碱胁迫的氮代谢机制。参考文献 References：1 Zhang Y，Shi Y，Hu X H，et al.Effects of exogenous spermidine o