外周血Th17_Treg细...重症肌无力发病中的作用研究_廖香玲.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）外周血Th17/Treg细胞及相关细胞因子在重症肌无力发病中的作用研究*廖香玲，农伟东，韦君翔，莫雪安，黄文（广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁530021）摘要目的：探讨Th17/Treg细胞及相关细胞因子在重症肌无力（MG）发病中的作用。方法：收集2018年10月至2020年12月在广西医科大学第一附属医院门诊或住院确诊的28例MG患者（MG组）及23例健康对照（HC组）的外周血标本，采用流式细胞术检测两组外周血单个核细胞（PBMCs）中Th17细胞及Treg细胞比例；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中细胞因子（IL-17、IL-6及TGF-）的表达水平；采用MG定量评分（QMG）评估患者病情严重程度，并分析Th17/Treg细胞比例与QMG评分之间的相关性。结果：与健康对照组比较，MG组外周血PBMCs中Treg细胞比例及Treg/Th17细胞比值升高（P0.05），Th17细胞比例差异无统计学意义（P0.05）。与健康对照组比较，MG组血清中Treg细胞相关的细胞因子TGF-表达水平降低（P0.05），IL-17、IL-6表达水平差异均无统计学意义（P0.05）。Th17/Treg细胞比例与患者病情严重程度QMG评分无显著相关性（P0.05）。结论：MG患者Th17/Treg细胞的转化及相关细胞因子水平存在一定的异质性。关键词重症肌无力；Th17细胞；Treg细胞；细胞因子中图分类号：R746.1文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1970-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.016The role of Th17/Treg cells and associated cytokines in the pathogenesis of myasthenia gravisLiao Xiangling,Nong Weidong,Wei Junxiang,Mo Xuean,Huang Wen.(Department of Neurology,The First Af-filiated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China）AbstractObjective:To investigate the role of Th17/Treg cells and associated cytokines in the pathogenesis ofmyasthenia gravis(MG).Methods:Peripheral blood samples were collected from 28 MG patients(MG group)and 23 healthy controls(HC group)who were diagnosed in the outpatient department or inpatient department ofthe First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University from October 2018 to December 2020.Flow cytome-try was used to detect the proportion of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of MG patients and healthy controls.The expressions of serum cytokines(IL-17,IL-6 and TGF-)were measuredby enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Quantitative myasthenia gravis score(QMG)was used to eval-uate the severity of the disease and the correlation between Th17/Treg cell ratio and QMG score was analyzed.Results:Compared with HC group,the proportion of Treg cells and the ratio of Treg/Th17 cells in PBMCs ofMG group increased(P0.05);there were no significant differences in the proportion of Th17 cells(P0.05).Compared with HC group,the expression of Treg cell-related cytokine TGF-in serum of MG group decreased(P0.05).There were no significant differences in the expressions of IL-17 and IL-6(P0.05).There was nosignificant correlation between Th17/Treg cell ratio and the patients QMG score of disease severity(P0.05).Conclusion:There is certain heterogeneity in Th17/Treg cell transformation and related cytokine levels in MGpatients.Keywordsmyasthenia gravis;Th17 cells;Tregcells;cytokines*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.82060236）；广西自然科学基金资助项目（No.2017GXNSFAA198042；No.2019GXNSFDA245032）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-09-30临床研究 1970重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种由自身抗体介导，细胞免疫依赖，补体参与，累及神经肌肉接头后膜，引起神经肌肉接头处信号传递障碍，出现波动性骨骼肌收缩无力的获得性自身免疫性疾病。据报道，MG在全球的患病率为（150250）/100万人，年发病率为（412）/100万人1。MG中约80%是由乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptorantibody，AChR-Ab）介导，极少部分由肌肉特异性酪 氨 酸 激 酶（muscle-specific receptor tyrosine ki-nase，MuSK）抗体、低密度脂蛋白受体相关蛋 4（low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4）抗体等介导2-3。CD4+T淋巴细胞通过激活B细胞产生抗体并分泌炎性细胞因子以诱导自身免疫反应，在MG中起关键作用。在抗原的刺激下，幼稚的CD4+T淋巴细胞可以增殖并分化为Th1、Th2、Th17和Treg效应T细胞亚群4。Th17细胞通过分泌细胞因子如白细胞介素-17（interleukin，IL-17）参与炎性反应，与多种自身免疫性疾病的发生密切相关；Treg细胞通过分泌细胞因子如白细胞介素-10（interleukin，IL-10）和 肿 瘤 生 长 因 子-（tumorgrowth factor-，TGF-）抑制自身反应性效应T细胞的活化和增殖，维持外周免疫耐受5-6。Th17细胞与Treg细胞的发育过程密切相关，在初始分化阶段对TGF-都有共同的需求，随后IL-6在促炎性Th17细胞与抗炎性Treg细胞之间的表达平衡中起关键作用7。Th17/Treg细胞之间保持动态平衡对维持着机体稳定免疫功能具有重要意义，两者表达失衡被认为可能是驱动自身免疫性疾病的一个关键因素，近年来已成为自身免疫性疾病的研究热点及新的治疗靶点8-9。MG在临床治疗中突出的问题包括部分患者不能达到治愈的目标，使用免疫抑制剂有增加感染的风险，激素减量或停药后复发等。同时，约有10的MG患者对免疫治疗疗效不佳或难以耐受，被认为是难治性MG。据统计，高达80的患者无法实现完全缓解10。本研究通过分析Th17/Treg细胞及细胞因子（IL-17、TGF-及 IL-6）在外周血中的表达，探讨它们在MG发病中的作用，以期为MG临床治疗提供新思路。1对象与方法1.1研究对象选取2018年10月至2020年12月在广西医科大学第一附属医院门诊或住院确诊的MG患者28例，其中男11例，女17例，年龄1868岁，平均（43.016.1）岁。病例纳入标准：（1）年龄1870岁；（2）符合典型的MG临床症状表现，如骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解；（3）新斯的明试验阳性或神经重复电刺激递减试验阳性。排除标准：（1）合并其他自身免疫性疾病；（2）就诊前3个月内使用过免疫抑制剂或糖皮质激素。按改良Osserman 临床分型将MG患者分为眼肌型MG（OMG）12例（42.9%）及全身型MG（GMG）16例（57.1%）。根据胸腺影像学及病理学结果将MG患者胸腺分为胸腺正常21例（75%），胸腺增生 1 例（3.4%）及胸腺瘤 6 例（21.4%）。按AChR-Ab 浓度0.45 nmmol/L 为阳性标准，入组MG患者AChR-Ab阳性为24例（85.7%）。选取同期在本院体检中心进行健康体检的23例志愿者为对照组，其中男 9 例，女 14 例，年龄 2553 岁，平均（37.18.5）岁，均无感染或自身免疫病史。两组性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P0.05）。本研究已通过医院伦理委员会批准，并与所有提供血液标本的受试者签署相应的知情同意书。1.2主要试剂和仪器PE Mouse Anti-Human CD4、Alexa Fluor 647Mouse anti-Human FoxP3均购自BD公司；PE/Cya-nine 7 anti-mouse IL-17AAntibody购自Biolegend 公司；Ficoll-Hy-panque细胞分离液、佛波酯（PMA）、离子霉素购自Sigma公司；莫奈霉素购自Enzo公司；IL-17AHuman 酶联免疫吸附试验（ELISA）Kit、IL-6Human ELISA Kit、TGF-Human ELISA Kit均购自Thermo公司。流式细胞仪购自BD公司；酶标仪购自BioTek公司。1.3方法1.3.1 标本收集晨起时采集入组MG患者及健康对照静脉血各10 mL，5 mL静脉血室温静置30 min后，以3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，置于-80 冰箱冻存。5 mL静脉血肝素抗凝保持分离，廖香玲，等.外周血Th17/Treg细胞及相关细胞因子在重症肌无力发病中的作用研究 1971广西医科大学学报2022 Dec；39（12）提取外周血单个核细胞（PBMCs），待流式细胞学检测用。1.3.2外周血 Th17 及 Treg 细胞检测采用 Ficoll密度梯度离心法获取PBMCs，将细胞密度调至2106个/mL并加入无菌培养板中，分别滴加PMA、离子霉素及莫能霉素，共培养5 h；洗涤后加入荧光标记单抗Anti-CD4-PE（Treg细胞多加Anti-CD25-PE）混匀，室温避光孵育20 min；加入破膜试剂溶解细胞膜，洗涤离心后分别加入胞内荧光标记单抗（Anti-IL-17A-PE-Cy7 及 Anti-FoxP3-Alexa Fluor 647）混匀，室温避光孵育20 min；洗涤后使用流式细胞仪检测Th17及Treg细胞占CD4+T淋巴细胞比例。1.3.3ELISA法检测血清细胞因子将前期冻存的血清标本于4 解冻，采用ELISA双抗体夹心法检测两组血清IL-17A、IL-6和TGF-表达水平，实验中设置空白对照组和阴性对照，操作过程严格按照产品说明进行，最后加入终止液混匀后于酶标仪（450 nm处）读取各样品光密度值（OD值）。通过标准曲线计算出各样本浓度。1.3.4病情评估根据MG定量评分（QMG）评估患者病情严重程度。1.4统计学方法采用 SPSS 23.0 统计软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以平均值标准差（x s）表示，组间比较采用独立样本检验。不符合正态性分布计量资料以中位数（四分位数间距）M（P25P75）表示，组间比较采用非参数检验独立样本曼-惠特尼U检验。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用2检验。采用Pearson相关系数检验进行两个指标之间的相关性分析。以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1MG患者外周血中Th17/Treg细胞占CD4+T淋巴细胞比例MG 组及 HC 组外周血中 Th17 细胞占 CD4+T 淋巴细胞比例分别为（0.940.64）%和（0.840.51）%，组间比较差异无统计学意义（P0.05）。MG 组外周中 Treg 细胞占 CD4+T 淋巴细胞比例（8.442.91）%，高于 HC 组的（5.161.72）%（P0.01）。MG组Treg/Th17细胞比值（13.059.49）高于HC组（8.826.06）（P0.05），见图1。2.2MG患者外周血Th17/Treg细胞相关的细胞因子IL-17A、IL-6 和 TGF-表达水平MG组和HC组中的Th17细胞相关的细胞因子IL-17 表达水平分别为 7.28（1.4819.76）pg/mL 和3.56（2.0910.97）pg/mL，组间比较差异无统计学意义（P0.05），而 MG 组 血 清 TGF-表 达 水 平（217.13190.49）pg/mL低于HC组（369.44123.86）pg/mL（P0.05）。以 IL-62 pg/mL 为参考水平，MG 组与 HC 组 IL-62 pg/mL 和 IL-62 pg/mL 例数所占比例，差异无统计学意义（P0.05），见图2。2.3MG患者Th17/Treg细胞与QMG评分的相关性分析对 28 例 MG 患者病情严重程度进行 QMG 评分，将MG患者Th17/Treg细胞比例与QMG评分进行相关性分析。结果显示，Th17/Treg细胞比例与QMG评分无显著相关关系（P0.05），见图3。图1MG组和HC组外周血中Th17/Treg细胞占CD4+T淋巴细胞比例 19723讨论MG是一种以神经肌肉接头抗原受体为靶点的器官特异性自身免疫性疾病，其发病涉及多种免疫机制，除了体液免疫，近期研究证实细胞免疫缺陷也参与MG发病11。Th17细胞以表达标志性细胞因子IL-17和转录因子维甲酸相关孤儿受体t（reti-noid acid receptor-related orphan receptor t，RoRt）为特征。IL-17是一种多效性的炎症介质，主要由Th17细胞分泌，已在多种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮患者的血清和靶组织中检测到IL-17的表达12。研究发现，Th17细胞比例显著增高，IL-17表达亦显著增加，Th17细胞通过分泌IL-17促使AchR-Ab IgG2b表达水平升高和诱导B细胞耐受的缺失参与实验性MG的发病13-14。但该结论在临床研究中尚存争议，如Masuda等15研究显示，MG患者外周血Th17细胞比例与健康对照组无显著差异。国内研究结果发现，与健康对照组比较，伴胸腺瘤MG患者外周血Th17细胞比例、IL-17水平显著升高，且与疾病严重程度相关，而伴胸腺增生MG患者及正常胸腺MG患者未发现类似改变16，说明Th17细胞比例变化可能与胸腺瘤关系密切。本研究中，与健康对照组比较，MG患者外周血Th17细胞比例及血清IL-17表达水平差异无统计学意义，Th17细胞与QMG评分无显著相关性，可能与本研究纳入伴胸腺瘤MG患者较少有关。Treg细胞通过细胞间接触抑制和分泌具有免疫抑制作用的细胞因子（如IL-10、IL-35及TGF-）下调炎症及免疫反应，有效抑制自身反应性效应T细胞的活化、增殖，以维持外周免疫耐受6。近年来对MG患者Treg细胞的数量和功能进行了广泛的研究，尽管有争议，但多数研究表明MG患者外周血中Treg细胞数量无显著变化。Treg细胞功能缺陷是MG发病的重要机制，其主要原因是对Treg细胞分化发育和功能有重要作用的转录因子 Foxp3表达图2MG患者和健康对照血清IL-17A、TGF-及IL-6表达水平比较图3MG患者外周血Th17/Treg细胞与QMG评分的相关性廖香玲，等.外周血Th17/Treg细胞及相关细胞因子在重症肌无力发病中的作用研究 1973广西医科大学学报2022 Dec；39（12）缺失17-19。Sun等20研究发现，与健康对照比较，病情稳定的MG患者外周血中Treg 细胞数量显著增高，而症状未控制的MG患者外周血Treg 细胞数量稍低，考虑MG患者外周血Treg细胞的数量与患者病情稳定性有关。本研究MG组外周血Treg细胞的比例高于HC组，可能与本研究纳入MG患者多数为门诊患者，病情较轻和稳定有关。MG患者体内免疫反应异常活跃，Treg细胞比例升高也可能是机体反馈机制，Treg细胞抑制自身免疫反应，以维持免疫耐受作用。TGF-是机体内重要的内源性免疫抑制性细胞因子，对细胞的生长分化和免疫功能有重要的调节作用，可抑制免疫活性细胞的增殖。TGF-信号对控制T细胞耐受是必不可少的，T细胞TGF-信号缺陷或完全丧失的小鼠会出现严重的自身免疫性疾病。有研究者通过检测实验性MG小鼠血清发现，在实验性MG小鼠肌无力症状改善的同时常伴随TGF-表达水平增高21。本研究中MG患者血清TGF-表达水平减低，与何志义等22的研究结果相一致，其机制目前并不十分清楚，推测可能与TGF-参与免疫病理过程中被大量消耗有关。IL-6具有多种生物学活性，能激活B淋巴细胞分化为产生抗体的浆细胞，在调节免疫球蛋白的合成中发挥重要作用。研究发现，MG患者血清中IL-6水平升高，且与血清 AchR 抗体浓度呈正相关关系23。此外，在获得性免疫反应中，IL-6 可诱导CD4+幼稚T细胞的特异性分化，在调节Th17细胞和Treg细胞之间的平衡中起着关键作用。有学者报道，给实验性MG模型大鼠注射抗IL-6抗体可抑制肌无力症状，同时伴有肌无力大鼠抗AChR-Ab效价的下降及B细胞数量的减少24。这些研究结果表明，IL-6可能与实验性MG和MG的发生、发展有关。本研究中，与健康对照组比较，MG患者血清中IL-6表达水平差异无统计学意义，可能与本研究大多数患者为轻症患者，免疫功能紊乱程度较轻有关。综上所述，MG 患者外周血 Treg 细胞比例及Treg/Th17细胞比值升高，可能与MG患者免疫耐受有关，而TGF-表达水平下降，可能与MG患者体内免疫抑制功能下降有关。说明MG患者Th17/Treg细胞的转化及相关细胞因子水平存在一定的异质性。本研究不足之处在于纳入的MG患者样本数量较少，因此未能将MG患者进行分组，分为OMG和GMG进行比较。扩大MG患者样本数量并进行分组研究是本团队今后继续研究的方向。参考文献：1GILHUS N E,VERSCHUUREN J J.Myasthenia gravis:subgroup 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