依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响_王玲.pdf

8Hankey GJ.Stroke J Lancet，2017;389(10069):641-54.9Lv J，Hu W，Yang Z，et al Focusing on claudin-5:a promising candi-date in the regulation of BBB to treat ischemic stroke J Prog Neuro-biol，2018;161:79-9.10Wytrykowska A，Prosba MM，Nyka WM，et al IL-1，TNF-，and IL-6 levels in gingival fluid and serum of patients with ischemic strokeJ J Oral Sci，2016;58(4):509-13.11Bowers JL，Tyulmenkov VV，Jernigan SC，et al esveratrol acts as amixed agonist/antagonist for estrogen receptors alpha and beta J Endocrinology，2000;141(10):3657-67.12Xie S，Sinha A，Singh BK，et al esveratrol induces insulin gene ex-pression in mouse pancreatic-cells J Cell Biosci，2013;3(1):47.13Lara F，Giuseppe P，Edoardo P，et al Synergistic association of val-proate and resveratrol reduces brain injury in ischemic stroke J IntJ Mol Sci，2018;19(1):172.14Yu P，Wang L，Tang F，et al esveratrol pretreatment decreases ische-mic injury and improves neurological function via sonic hedgehog sig-naling after stroke in rats J Mol Neurobiol，2017;54(1):212-26.15Koronowski KB，Khoury N，Saul I，et al Neuronal SIT1(Silent In-formation egulator 2 Homologue 1)regulates glycolysis and medi-ates resveratrol-induced ischemic toleranceJ Stroke，2017;48(11):3117-25.16Liu XS，Chopp M，Zhang L，et al MicroNA profiling in subven-tricular zone after stroke:mi-124a regulates proliferation of neuralprogenitor cells through Notch signaling pathwayJ PLoS One，2011;6(8):e23461.17Peng H，Yang H，Xiang X，et al MicroNA-221 participates in cere-bral ischemic stroke by modulating endothelial cell function by regu-lating the PTEN/PI3K/AKT pathway J Exp Ther Med，2020;19(1):443-450.18Luo S，Li H，Mo Z，et al Connectivity map identifies luteolin as atreatment option of ischemic stroke by inhibiting MMP9 and activa-tion of the PI3K/Akt signaling pathway J Exp Mol Med，2019;51(3):1-11.19Fan W，Li X，Huang L，et al S-oxiracetam ameliorates ischemicstroke induced neuronal apoptosis through up-regulating 7 nAChand PI3K/Akt/GSK3 signal pathway in rats J Neurochem Int，2018;115:50-60.20Wu D，Shi J，Elmadhoun O，et al Dihydrocapsaicin(DHC)en-hances the hypothermia-induced neuroprotection following ischemicstroke via PI3K/Akt regulation in rat J Brain es，2017;1671:18-25.21Lv H，Li J，Che YQ，et al CXCL8 gene silencing promotes neuroglialcells activation while inhibiting neuroinflammation through thePI3K/Akt/NF-B-signaling pathway in mice with ischemic stroke.J J Cell Physiol，2019;234(5):7341-55.2022-01-19 修回(编辑张艳利)依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响王玲1杨馥宇2黄超1(华北理工大学附属医院1 呼吸科，河北唐山063000;2 眼科)摘要 目的探讨依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响。方法采用随机数字表法将 96 只Wistar 大鼠分为对照组、5%间歇低氧(IH)组及依达拉奉(ED)组，每组又分为 1 d、3 d、7 d、14 d 4 个时间点，每个时间大鼠 8只。透射电镜观察大鼠海马 CA1 区神经细胞的超微结构;免疫组织化学法观察大鼠神经细胞自噬效应蛋白(beclin)-1、微管相关蛋白 1 轻链(LC)3-蛋白的表达;原位末端标记法记录大鼠神经细胞的凋亡情况。结果电镜下对照组神经细胞形态正常，染色质均匀，线粒体、高尔基体等细胞器结构正常;与对照组比较，5%IH 组从间歇低氧损伤 3 d 开始逐渐出现神经元变形肿胀，核膜模糊，染色质密度欠均匀，线粒体空泡化、嵴出现断裂，激活溶酶体，出现自噬小体，随着低氧时间的延长，损伤越重;与 5%IH 组比较，ED 组各个时间点神经元超微结构损伤减轻，自噬小体数目增多。对照组神经细胞 beclin-1、LC3-的表达较少，各个时间点差异无统计学意义(P0.05);与对照组比较，5%IH 组及 ED 组各个时间点 beclin-1、LC3-蛋白的表达显著增多(P0.05);与 5%IH 组比较，ED 组各个时间点 beclin-1、LC3-蛋白的表达显著增多(P0.05)。对照组神经细胞凋亡较少，各个时间点细胞凋亡指数无差异(P0.05);与对照组比较，5%IH 组及 ED 组各个时间点细凋亡指数显著增加(P0.05);与5%IH 组比较，ED 组各个时间点凋亡指数显著下降(P0.05)。结论依达拉奉可提高早期间歇低氧大鼠神经细胞的自噬水平，进而减少神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用。关键词 间歇低氧;自噬;凋亡;自噬效应蛋白(beclin)-1;微管相关蛋白 1 轻链(LC3)-中图分类号 563.9 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0660-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.039基金项目:河北省医学科学研究课题(20201244，20210742)第一作者:王玲(1987-)，女，硕士，主治医师，主要从事睡眠呼吸暂停低通气综合征研究。阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)主要是间歇性缺氧，可导致多系统损害，尤其是神经系统，备受人们的关注1。体外动物试验显示间歇低氧可导致神经细胞的凋亡，是神经系统损伤的主要机制之一2。同时间歇低氧可引起神经细胞自噬的出现3。既往对间歇低氧早期导致神经细胞凋亡及自噬已有相关报道，但罕有应用临066中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷床药物干预来探讨早期间歇低氧损伤后自噬在神经细胞凋亡中发挥作用的研究。本实验应用临床上氧自由基清除剂依达拉奉干预，探讨依达拉奉对早期间歇低氧大鼠神经细胞自噬与凋亡的影响。1材料与方法1.1主要仪器、试剂自噬效应蛋白(beclin)-1 及微管相关蛋白 1 轻链(LC)3-兔抗鼠多克隆抗体、免疫球蛋白(Ig)G 羊抗兔单克隆抗体、PV6001 试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司，TUNEL 试剂盒由瑞士 oche 公司提供，H-7650 透射电镜由日本日立公司提供。1.2实验动物及分组96 只雄性 Wistar 大鼠，采用随机表法分为对照组、5%间歇低氧(IH)组及依达拉奉(ED)组，每组又分为 1 d、3 d、7 d、14 d 4 个亚组，每个亚组 8 只大鼠。1.3动物模型的制备5%IH 组大鼠实验箱内首先注入流速为 10 L/min 的氮气 30 s，使试验箱内的氧浓度降至 5%，半分钟后注入流速为 10 L/min 的空气 40 s，使氧浓度至 21%，再注入 50 s 的空气，流速改变为 5 L/min，使氧浓度维持 21%。按上述操作，每 2 min 为 1 个周期循环。ED 组大鼠尾静脉注射依达拉奉(3 mg/kg)，30 min 后置于低氧箱内，与IH 组大鼠实验一致。对照组大鼠实验箱内持续注入流速为 3 L/min 的空气，氧浓度保持在 21%。以上3 组实验均每日进行 8 h，持续进行 1 d、3 d、7 d、14 d。1.4透射电镜标本制备实验结束后，对大鼠进行麻醉及灌注固定术后，于冰上取出海马组织，修剪成1 mm1 mm1 mm 大小的组织块，分别进行预固定(2.5%戊二醛，时间为 4 h)、固定(1%锇酸缓冲液，时间为 2 h)。固定结束后，进行脱水、包埋、超薄切片、染色等步骤，最后于电镜下摄片。1.5免疫组织化学法检测蛋白的表达脑组织经脱水、透明、包埋等步骤后进行切片，供组织化学法应用。按 PV 法进行组织化学法操作步骤，将切好的完整切片脱蜡、脱水、高压修复后，分别滴加一抗(beclin-1 兔抗大鼠抗体、LC3-兔抗大鼠抗体)，4冰箱内过夜，滴加二抗等，按二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒操作步骤进行显色后，进行脱水、透明、封片。1.6Tunel 法计算神经细胞的凋亡情况海马组织切片进行脱蜡、脱水后经 3%浓度的过氧化氢(H2O2)室温浸泡、TBS 溶液漂洗、加入蛋白酶 K 工作液、TBS 溶液漂洗、加入 TUNEL 工作液、TBS 溶液漂洗、加入山羊血清工作液进行封闭、加入 POD-转化液等，按试剂盒操作步骤进行显色、苏木素复染、脱水、透明、封片，最后进行摄片。应用 Image-ProPlus 图像分析软件进行分析，神经细胞凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数100%。1.7统计学方法采用 SPSS22.0 软件进行单因素方差分析、独立样本 t 检验。2结果2.1透射电镜观察海马 CA1 区神经细胞的超微结构对照组神经细胞形态正常，染色质均匀，线粒体、高尔基体等细胞器结构正常;与对照组比较，5%IH 组从间歇低氧损伤 3 d 开始逐渐出现神经元变形肿胀，核膜模糊，染色质密度欠均匀，线粒体空泡化、嵴出现断裂，激活溶酶体，出现自噬小体，随着低氧时间的延长，损伤越重;与 5%IH 组比较，ED 组各个时间点神经元超微结构损伤减轻，自噬小体数目增多。见图 1。图 1透射电镜下观察各组海马 CA1 区神经细胞超微结构(15 000)166王玲等依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响第 3 期2.2免疫组织化学法检测 beclin-1、LC3-蛋白的相对表达对照组神经细胞 beclin-1、LC3-蛋白表达较少，各个时间点差异无统计学意义(P0.05);与对照组比较，5%IH 组及 ED 组各个时间点神经细胞 beclin-1、LC3-的表达量显著增多(P0.05);与5%IH 组比较，ED 组各个时间点神经细胞 beclin-1、LC3-的相对表达量显著增多(P0.05)。见表1、图 2、图 3。表 13 组不同时间点 beclin-1 及 LC3-蛋白表达比较(%，xs，n=8)组别beclin-11 d3 d7 d14 dLC3-1 d3 d7 d14 d对照组21 2024120112 2920 33210205326518122501806265177631217 562 765%IH 组25661 751)34 802441)40993181)51382701)23582891)30464501)38983171)46323571)ED 组34572 411)2)39 883271)2)50 303051)2)59463 491)2)29183051)2)37 522761)2)45302781)2)55282731)2)F 值38.54476.869144.797236.78119.99446.189113.753170.392P 值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000与对照组比较:1)P0.05，与 5%IH 组比较:2)P0.05;表 2 同图 2光学显微镜下观察 3 组不同时间点 beclin-1 蛋白的相对表达(免疫组织化学法，400)图 3光学显微镜下观察 3 组不同时间点 LC3-蛋白的相对表达(免疫组织化学法，400)2.3TUNEL 法检测海马 CA1 区神经细胞的凋亡情况对照组海马 CA1 区神经细胞凋亡较少，各个时间点 AI 差异无统计学意义(P0.05);与对照组比较，5%IH 组及 ED 组各个时间点神经细胞 AI 显著增加(P0.05);与 5%IH 组比较，ED 组各个时间点神经细胞 AI 降低，差异有统计学意义(P0.05)。见表 2、图 4。266中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷表 2TUNEL 法检测各组神经细胞 AI 的比较(xs，n=8)组别1 d3 d7 d14 d对照组003800230040002500400029004100315%IH 组00620 0181)0 12200311)022400341)0 49500371)ED 组00490 0171)2)009200251)2)015900261)2)031500231)2)F/P 值13.753/0.00041.308/0.000145.475/0.000215.294/0.000图 4光学显微镜下观察各组不同时间点神经细胞凋亡的情况(TUNEL 染色，400)3讨论OSAHS 主要是指睡眠过程中反复出现上气道阻塞，引起睡眠暂停及低通气，进而导致一系列临床症状及并发症4。研究证实间歇低氧可导致神经系统损害，且机制复杂多样。其中间歇低氧导致神经细胞的凋亡是神经系统受损的重要机制之一5。细胞凋亡受多种因素的调节，是细胞的程序性死亡，凋亡与自噬密切相关，细胞凋亡受自噬活性的调节6。在脑缺血、脑创伤等神经损伤中自噬均被激活，进而发挥神经保护作用。beclin-1 及 LC3-均是特异的自噬诊断指标，分别是酵母中作为自噬密切相关基因 Atg6 及 Atg8 在哺乳动物体内的同源物7。在对胰腺癌干细胞的研究中发现，间歇性缺氧诱导了自噬相关蛋白 beclin-1、LC3-的表达，进而激活自噬8。本实验结果同样显示，间歇低氧早期促进了大鼠海马 CA1 区神经细胞的自噬相关蛋白 beclin-1、LC3-II 的表达，诱导了自噬的发生。依达拉奉是临床常用的一种抗氧化剂及氧自由基清除剂，广泛应用于脑梗死等多种神经系统疾病，可改善神经系统损伤9。通过模拟 OSAHS 发病机制制备间歇低氧模型，发现依达拉奉通过抑制氧化应激对间歇低氧损伤后神经细胞发挥保护作用10。动物实验也证实，依达拉奉能明显减少间歇低氧损伤后神经细胞的凋亡，但依达拉奉对间歇低氧自噬的影响研究尚少，本实验结果显示:依达拉奉可提高早期间歇低氧大鼠海马神经细胞的自噬水平，进而减少神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用。这与既往对蛛网膜下腔出血中依达拉奉对大鼠海马神经元自噬及凋亡影响研究结果一致11。综上所述，间歇低氧早期可导致神经元自噬及凋亡的出现，应用依达拉奉治疗后，可提高大鼠海马神经细胞的自噬水平，进而减少神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用，为临床早期治疗 OSAHS 提供动物实验证据。4参考文献1Tthov L，Celec P，Mucska I，et al Short-term effects of continuouspositive airway pressure on oxidative stress in severe sleep apnea J Sleep Breath，2019;23(3):857-63.2王玲，张盼盼，韩晓庆，等.细胞外信号调节激酶抑制剂对间歇低氧早期大鼠神经元凋亡及 P53 表达的影响 J 中华老年心脑血管病杂志，2019;21(7):754-8.3王玲，王袁，张嘉宾，等.细胞外信号调节蛋白激酶抑制剂对间歇低氧大鼠认知功能的影响 J 中华老年心脑血管病杂志，2020;22(8):866-70.4王玲，张盼盼，付爱双，等.间歇低氧对大鼠海马神经细胞突触相关蛋白表达及认知功能的影响 J 中华老年心脑血管病杂志，2020;22(5):534-7.5王玲，王袁，张嘉宾，等 依达拉奉对间歇低氧大鼠海马神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 J 中国呼吸与危重监护杂志，2021;20(9):632-66Lu HY，Wang W，Zhou Z，et al Treatment of obstructive sleep apnoea-hypopnea syndrome by mandible advanced device reduced neuron ap-optosis in frontal cortex of rabbits J Eur J Orthod，2018;40(3):273-80.366王玲等依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响第 3 期7Gao Y，Zhang Y，Fan Y.Eupafolin ameliorates lipopolysaccharide-in-duced cardiomyocyte autophagy via PI3K/AKT/mTO signaling path-way J Iran J Basic Med Sci，2019;22(11):1340-6.8Zhu H，Wang D，Zhang L，et al Upregulation of autophagy by hypoxi-a-inducible factor-1 promotes EMT and metastatic ability of CD133+pancreatic cancer stem-like cells during intermittent hypoxia J On-col ep，2014;32(3):935-42.9Sun Z，Xu Q，Gao G，et al Clinical observation in edaravone treatmentfor acute cerebral infarction J Niger J Clin Pract，2019;22(10):1324-7.10王玲，王袁，黄超，等 依达拉奉对间歇低氧大鼠神经细胞 Apaf1、Survivin 蛋白表达及认知功能的影响 J 中国老年学杂志，2022;42(15):3757-6011刘瑶，刘俊杰，吴寅秋，等.依达拉奉对蛛网膜下腔出血大鼠海马区神经元自噬及凋亡的影响 J 中国老年学杂志，2019;39(2):378-81.2021-10-20 修回(编辑王一涵)三七与丹参合剂对大鼠疼痛变化的影响付立波王一冰朱妮娜王紫怡(长春师范大学生命科学学院，吉林长春130032)摘要 目的探究不同浓度的三七与丹参合剂对大鼠疼痛变化的影响。方法选取 8 只大鼠，适应性训练后第 1天 8 只大鼠灌胃生理盐水，用热板与压板测痛仪测定灌胃前及灌胃后 5、10、15、20、30、45、60 min 后爪缩爪反应潜伏期(HWL)，作为对照组数据。适应性训练后第 2 天 8 只大鼠灌胃 20 95 mg/ml 三七与丹参合剂，用热板与压板测痛仪测定灌胃前及灌胃后 5、10、15、20、30、45、60 min HWL，作为低剂量组数据。适应性训练后第 3 天 8 只大鼠灌胃 41 90 mg/ml 三七与丹参合剂，同上方法测定灌胃后不同时间点 HWL，作为中剂量组数据。适应性训练后第 4 天 8 只大鼠灌胃 62 85 mg/ml 三七与丹参合剂，同上方法测定灌胃后不同时间点 HWL，作为高剂量组数据。正常大鼠在大鼠足底注射鹿角菜溶液制备炎症模型大鼠，同上方法在 5、10、15、20、30、45、60 min 时用热板与压板测痛仪进行测试，观察并记录 HWL。结果与灌胃生理盐水的大鼠相比，用三七与丹参合剂灌胃后的大鼠的 HWL 在 5 30 min 有明显提高，并且在 5 min 时效果最明显(P0.05)。结论三七与丹参合剂对大鼠具有一定的消炎止痛作用，三七与丹参合剂参与大鼠的痛觉调节。关键词 三七;丹参;痛觉中图分类号 Q423 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0664-04;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.040基金项目:吉林省科学技术厅自然科学基金项目(20200201110JC);吉 林 省 教 育 厅“十 三 五”科 学 技 术 项 目(JJKH20200826KJ);长春师范大学自然科学基金项目(长师大自然合字 2019 第 011 号)通信作者:朱妮娜(1980-)，女，讲师，硕士，主要从事天然药物提取及其生理机制研究。第一作者:付立波(1965-)，男，教授，硕士生导师，博士，主要从事基础生理学与神经生物学研究。三七有效成分提取物三七皂苷可修复受损的神经元1，而三七皂苷有 1、2、4、6 等物质2。丹参根及根茎有活血化瘀、安神养血、清心除烦等功能3，4，丹参中主要成分是丹参酮，丹参酮可阻止男性激素产生，减少皮脂产生，减轻由细菌引发的炎症疾病5，具有活血化瘀、改善微循环的作用，并且丹参酮对多种革兰阳性球菌抗菌感染有良好的抑制作用6，7，因此市场需求量大，开发利用价值高8，9。我们前期10，11研究发现，单体三七水煮液对大鼠有镇痛作用，而与丹参合剂对雄性正常大鼠和炎症大鼠痛觉变化的影响研究，在国内外尚未见报道，为了进一步验证三七与丹参中药合剂对大鼠的痛觉调节作用，本试验采用灌胃及行为药理学等方法，观察与记录不同浓度的三七与丹参合剂对大鼠痛觉变化的影响，为三七与丹参合剂在临床上镇痛应用提供理论依据，同时也为临床中药在镇痛方面的研究与开发提供了新的思路。1材料与方法1.1实验动物8 只雄性大鼠购于吉林大学试验动物中心，每个大鼠单独饲养，自由进食喝水，正常光照，温度 21 25。1.2药品主要成分为丹参与三七胶囊，购于长春市康爱大药房。将丹参与三七胶囊称量后置于瓷缸中，隔水加热制备成母液，之后用母液来配 制20.95、41.90、62.85 mg/ml 的丹参与三七的合剂。1.3主要仪器智能热板仪(型号为 YLS-3E)、电子压痛仪(型号为 YLS-6B)，均由安徽省正华生物仪器设备有限公司提供;灌胃针(型号为:810216)由上海化科实验器材有限公司提供。1.4大鼠疼痛实验1.4.1正常大鼠疼痛实验在进行行为学实验之466中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷