细胞外囊泡在肝纤维化进展中的作用机制及临床意义_王梓塨.pdf

-61-细胞外囊泡在肝纤维化进展中的作用机制及 临床意义 王梓塨1 邱 华2 朱玟霜1 李 旺1 蒙荫杰1 王倩倩1 （1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 530021）【摘 要】细胞外囊泡是多种细胞释放的双层膜结构的囊泡统称，囊括了外泌体、微囊泡、凋亡小体及肿瘤小泡，介导着细胞间物质交换及信号交流。肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病预后的重要环节，其中以肝星状细胞的活化为该环节的核心。文章具体综述了细胞外囊泡在不同层面参与肝纤维化的调控，主要是能通过传递核酸、蛋白质等参与调控肝星状细胞活化与迁移。【关键词】细胞外囊泡；外泌体；肝纤维化；肝星状细胞；生物标志物【中图分类号】R575 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1151(2022)12-0061-05 Mechanism and Clinical Significance of Extracellular Vesicles in the Progression of Hepatic Fibrosis Abstract:Extracellular vesicle is a general term for vesicles with double membrane structure released by various cells,including exosomes,microbubbles,apoptotic bodies and tumor vesicles,which mediate the material exchange and signal exchange between cells.Hepatic fibrosis is a key step in the development of various chronic liver diseases to cirrhosis and an important link affecting the prognosis of chronic liver diseases.The activation of hepatic stellate cells is the core of this link.More and more studies have shown that extracellular vesicles are involved in the regulation of liver fibrosis at different levels,mainly through the transfer of nucleic acids,proteins,etc.to participate in the regulation of hepatic stellate cell activation and migration.Key words:extracellular vesicles;exosomes;hepatic fibrosis;hepatic stellate cells;biomarkers 引言 细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是多种细胞释放的各种具有膜结构的囊泡统称，包括外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小泡等不同细胞亚群，在多种体液中分离出来，如血清/血浆、尿液、唾液、腹腔积液、羊水等1。起初 EVs被视为细胞代谢后废物排泄途径2，且因此被严重低估，但如今 EVs 已被证实是一种全新的细胞间信号交流方式。在生理或病理状态下，不同的细胞分泌携带不同组分的 EVs，这些EVs 最终被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流3,4。肝纤维化（Liver fibrosis，LF）是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病预后的重要环节，其典型特征是多种胶原蛋白及细胞外基质（ECM）的沉积。由于肝纤维化是一种可逆的病理过程，肝纤维化作为减少肝硬化、肝癌等危重症发病率的突破点一直被高度关注。长期以来，学者针对 ECM 产生进行了大量溯源研究，最终确定肌成纤维细胞（MFB）是 ECM 的主要来源细胞5。MFB 是来源于肝脏自身的活化肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）经历表型分化产生的，HSC 的活化为 ECM 的沉积奠定了基础，因此 HSC 活化是肝纤维化进展“通道”的核心地位已基本达成共识6，并由此催生了针对 HSC 活化机制的研究探索，以寻求开发肝纤维化的新疗法。最近，一种新的肝脏内外源性信号网络被发现，肝脏内外不同细胞间涉及依赖细胞外囊泡传递核酸、蛋白质等信号分子，靶向 HSC，通过影响 HSC 的活化与迁移对肝纤维化演变起双向调控作用7-9。因此，围绕EVs 信号网络展开探索不同细胞分泌的 EVs 在肝纤维化发病及进展中的作用机制及潜在的诊疗价值，有助于拓宽肝纤维化的诊疗策略，提高肝纤维化的诊疗水平。总第 24 卷 280 期 大 众 科 技 Vol.24 No.12 2022 年 12 月 Popular Science&Technology December 2022 【收稿日期】2022-05-25【基金项目】国家自然科学基金项目（No.81860889）；广西自然科学基金资助项目（2020GXNSFAA297113）。【作者简介】王梓塨（1996），男，广西中医药大学在读硕士研究生，研究方向为中医药（壮医药）防治慢性肝病的基础与临床研究。-62-1 EVs 定义及分类 细胞外囊泡是指从多种细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径在 40 nm1000 nm 之间10。根据胞外囊泡直径不同，可分为外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小泡四种亚群：一类是 EVs 由多囊泡体与质膜融合后包裹亲本细胞中的核酸，蛋白质等物质释放到细胞外，称为外泌体，直径在 30 nm150 nm 之间；一类则是直接从质膜上脱落，称为微囊泡（microvesicle），直径在 150 nm1 m之间；一类是在细胞凋亡过程中产生的，通过自噬体形成及发芽脱落至胞外，称为凋亡小体（apoptotic body，ApoBDs），直径为 1 m5 m；一类是肿瘤小泡（large oncosomes），在肿瘤细胞中发现，直径为 1 m10 m11。长期的实验研究发现，EVs 不同亚群中以外泌体与肝纤维化关系最为紧密，因此，本文 EVs 除外特殊交代，均指外泌体。2 EVs 介导肝星状细胞的活化和迁移 2.1 EVs 介导肝星状细胞活化介导肝星状细胞活化 目前认为，HSC 活化分为启动阶段和持续阶段。启动阶段表现为肝损伤时，TGF1 通过丝氨酸/络氨酸激酶途径激活Smad2 和 Smad3 并磷酸化，TGF1 受体复合物转运进入静息型 HSC 胞质，与 Smad4 形成异源三聚体复合物异位进入细胞核，与 DNA 结合后，通过和转录因子的相互作用，上调-平滑肌动蛋白（-SMA）及胶原相关基因的转录和翻译，活化 HSC，产生 ECM。活化 HSC 又可作用于静止 HSC 促使更多 HSC 激活，此为 HSC 活化的持续阶段。整个过程有多条信号通路的参与，如 TGF/Smad3、JAK-STAT、Wnt/-catenin等12,13。HSC 活化后，会朝向炎症损伤部位迁移，参与损伤肝组织的修复，加重瘢痕沉积和肝功能损伤14。通过总结前人的实验成果发现，损伤肝细胞、活化的 HSC 及肝外细胞均可释放 EVs 参与 HSC 活化。2.1.1 损伤的肝细胞释放损伤的肝细胞释放 EVs 诱导诱导 HSC 活化活化 JAK-STAT 信号通路的激活与 HSC 活化及转分化相关15，受 SOCS3 蛋白严格调节。SOCS3 蛋白能阻断 JAK 与 STAT相结合并靶向蛋白酶体降解的蛋白质来沉默该途径16。有相关报道记载17，经丙肝病毒感染而损伤的肝细胞，会高度表达miR-19a 并经由外泌体靶向静止 HSC，miR-19a 在静止 HSC被内化，通过结合 HSC 内 SOCS3 的 3未翻译区域（UTR），下调 SOCS3 表达量，激活 JAK-STAT 下游信号通路传导，诱导静息 HSC 活化及转分化，同时增加 TGF-1 基因表达，加速 Smad3 磷酸化，增强纤维化标志物基因表达；之后，利用具有阻断 JAK-STAT 通路激活的化学抑制剂 Stattic 处理经miR-19a 处理的 LX2 细胞，TGF-1、CTGF 和 TIMP1 基因的表达显著减弱。PPAR-过表达与人类 HSCs 失活及肝纤维化消退呈现正相关18。Davide19研究发现，非酒精脂肪性肝纤维的患者，体内脂毒性肝细胞衍生的 EVs（hp-evs）能显著诱导 HSC 从静止型到活化型的转化，其可能的原因是脂毒性肝细胞通过衍生 hp-evs 转移脂毒性肝细胞 miR-128-3p 至静止HSC，靶向静止 HSC 内过氧化物酶体增殖剂激活受体 PPAR-并诱导其表达的下调，促进了 HSC 的活化、迁移和增殖。2.1.2 活化活化 HSC 分泌分泌 EVs 促进静息型促进静息型 HSC 的活化的活化 经研究，不仅受损肝细胞相关 EV 可诱导 HSC 激活，活化后的 HSC-EV 亦有促进静息型 HSC 活化的作用，此途径可能依赖于 HSC 的旁分泌机制。Li 等20观察发现，活化 LX-2细胞旁分泌 HSC-EV，HSC-EV 会主动靶向静止 HSC，释放FN1 纤连蛋白，之后，FN1 蛋白将以细胞表面整合素 51 为受体，二者相结合，促使靶细胞静止 HSC 激活，并促使活化HSC 细胞的迁移，同时上调基质金属蛋白酶或 I 型胶原的表达，肝纤维化呈正向发展。另据 M.A21、Yuan O22报道，EV FN1 也可能直接参与了 HSC-EV 的下游促纤维化作用。2.1.3 来源于肝外细胞来源于肝外细胞 EVs 可诱导可诱导 HSC 活化活化 研究9表明，在荷肺癌瘤小鼠骨髓来源细胞（BMDCs）来源的 EVs 中，miR-92a 被大量表达，EVs miR-92a 可直接抑制其靶标 Smad7，导致转化生长因子-信号转导增强，激活小鼠 HSC 及上调型胶原的表达；该团队在临床上也发现肺癌患者血清中循环 miR-92a 水平升高，从这些患者骨髓来源细胞分离的 EV 具有类小鼠 BMDCs EVs 的能力，可过表达miR-92a 而促进人 HSC 的活化。可见，多类细胞促 HSC 活化作用主要是通过 EVs 转导 miRNAs 及蛋白实现的，并且在实验阶段证实了阻断EV-miRNA及蛋白诱导的HSC激活可能延缓肝纤维化的进展。2.2 LSEC-EVs 介导肝星状细胞的迁移介导肝星状细胞的迁移 在肝组织损伤时，活化的 HSCs 会朝着损伤部位迁移，参与组织修复及 ECM 重塑，此过程的发生可能与邻近肝血窦内皮细胞（LSEC）分泌的因子调控有关23。肝纤维化发生时，LSEC 内高度表达 SK1，过表达的 SK1 衍生 HSC 趋化因子S1P，并经由 LSECs-EVs 包装，LSEC-EVs 转导信号通路SK1/S1P 到病理性的 HSC，通过诱导 AKT 磷酸化，促进 HSC的信号转导与迁移，加重肝纤维化24。另据报道14，应用中药红景天提取物红景天苷则能通过减少肝窦内皮细胞来源的胞外体 SK1 诱导的 HSC 活化和迁移，显著抑制 CCl4 诱导的小鼠肝纤维化，这提示，部分中药提取物可能通过外泌体途径干预 HSC 的次级细胞反应来发挥抗肝纤维化的作用。3 EVs 介导促肝纤维化因子 CTGF 调控纤维化进程 CTGF 是一种高度促纤维化的分子，在许多纤维化疾病中，CTGF 与 TGF-的表达同步增高。然而，TGF-主要在组织纤维化病变的早期表达，而 CTGF 在肝纤维化整个进程中均持续表达，因此部分学者将调控 CTGF 的表达视作为理解肝纤维化的新手段25。有研究团队就发现20,26，在肝纤维化起始或下游事件中，CTGF 浓度会随着 HSC 的激活而显著上升，而 miR-214、miR-199a-5p 等抑制 CTGFmRNA 转录的miRs 含量则下降，纤维化表现为递进式发展。这完全相反的-63-两种结果，与 HSC-EV 转移 EV-CTGF/CTGFmRNA 有关。活化的 HSC 通过外泌体途径，转移 HSC EV-CTGF/CTGFmRNA至静止型 HSC 并促进其活化，其最终结果是以 SMA mRNA或蛋白过表达，纤维化信号被放大；同时，两种通过Twist-1-miR-199a-miR-214 外泌体途径靶向 CTGF 非翻译区而抑制 CTGF 表达翻译的 miRNA 表达受抑制。4 EVs肝纤维化发生及预后评估潜在生物标志物 目前，肝活检组织病理学检查仍是临床上诊断肝纤维化的“金标准”。但由于肝活检属于创伤性检查，少数病例可能会发生并发症，如疼痛、出血、感染甚至死亡，不易被患者接受，且费用较高，应用推广受限27。因此，一种无创且安全的肝纤维化检查手段呼声较高。EVs 由多种细胞分泌并存在于生物体液中，使 EVs 在体液检测中具有吸引力。此前，张辰宇教授报道了 miRNA 可在人类和动物的血清和血浆中稳定存在28，此报道更是将 EV-miRNA 作为生物标志物的研究推向顶峰。EV-miRNA 之所以能稳定存在于不同体液中，与 EVs 双层膜结构以及自身拥有的核糖核酸酶类抗性有关，凭借这一特性，EV-miR 具有高稳定性、存在于多种生物体液标本等优点。Li 等20的实验不仅证实 EXo-miR-19a 的促纤维化作用，该团队还发现，HCV 感染的肝细胞和慢性 HCV肝纤维化患者与健康志愿者和非HCV相关肝病肝纤维化患者血清中 EX-miR-19a 含量存在表达差异。其他 EVs-miRNA 如血清 EXo-miR122 水平的降低与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者严重纤维化的发生有关29。从这些报道中可以看到，血清中存在涉及肝纤维化病因及分期的 EV-miR，提取并检验出不同类别的 miRNA，分析其含量变化，则可能知晓肝纤维化的成因、分期及预后。因此，越来越多学者倾向于将 EV-miRNA 视作是无创肝纤维化活检极具潜力的一类新靶标。不过，研究者们也注意到了，EVmiRNA 在释放至血清前，大多数已被受体细胞摄取利用，导致体液 EV 中的固有核酸量较低30；更糟糕的是，在抽取的血清样本中，不仅有EV-miRNA，还含有数量不等的诸如 RNA 复合物等非囊泡大分子结构，这可能会对 EV-miRNA 提纯、分离及检测产生较大干扰。因此，开发有效的提取程序和灵敏的检测策略非常重要，特别是在微量液体中找寻稀有分子靶标。目前，传统的手段有沉淀和自旋柱、聚合酶链反应（PCR）选择性地扩增靶序列，这两种方法的联合应用可以获得所提取 RNA 的质量、大小及定量验证31，具有提纯度高、定量准确、反复读取利用的优点，然而，操作起来却费时费力，通量、灵敏度有限31,32。为了实现更高效、快速检测，新兴检测手段“飞沫聚合酶链反应 液滴数字 PCR（ddPCR）技术33、离子交换奈米探测器34”应运而生。该方法具有检测时间短、灵敏度高、更高的裂解速率等优势，但仍存在样品丢失量大、费用昂贵等不足。因此，如何进一步改进 EV-miR 检测手段尤为重要，如开发一种用于单一 EVs 分析的技术，建立 EVs生物标志物的参考数据库35等。另外，由于操作者操作水平高低不同，还应将人为操作因素作为统计分析时的生物变量。5 EVs逆转肝纤维化潜在“方向标”EV 蛋白、核酸载物可以有效地运输到受体细胞并由受体细胞吸收，以在体外和体内引发有效的细胞反应，因此它们常被用于递送纳米级调节性 RNA、蛋白质等成为免疫调节36与组织修复37的治疗剂，成为了基因治疗的理想载体。此外，有研究者还利用 EVs 的靶向性，将 EVs 设计成在其表面上存在靶向配体，并在其内封装药物，精准靶向病变部位38。然而，长期实验却发现，EVs 的给药方式，存在半衰期短39，靶向有限，有效载荷不足和施用后快速清除的缺陷40。因此，EVs药物靶器官的给药系统距离临床的推广使用仍有较长的路要走。肝纤维化病因，可大致分为感染性、慢性酒精中毒、自身免疫性肝病等。目前治疗肝纤维化首选方法是去除病因，如有效抑制和清除慢性肝炎病毒（HBV 和 HCV）等。然而，有效的病因治疗虽可以减缓甚至逆转部分肝纤维化，但仅少部分患者肝硬化可逆转。深入研究后发现，一旦 HSC 被激活，即使有效病因治疗仍不能阻止肝纤维化的进展，因此，围绕HSC 活化开展的治疗才是抗纤维化的特异性手段41。有研究报道了间充质干细胞（MSCs）及源性 EVs 可以显著减轻肝纤维化，其主要作用机制就是抑制了 HSC 的活化与增殖，其中，MSCs-EVs 无细胞疗法较亲本 MSCs 细胞移植具有小分子、高安全性、低免疫原型等优势42,43，因此，MSC-EVs 已成为当下学者研究治疗肝纤维化的焦点。MA 等44发现，MSC-EVs可抑制 LX-2 细胞的激活，阻滞细胞增殖周期，并诱导其凋亡，同时减少纤维化标记-SMA 和胶原蛋白的表达。此外，当将CircDIDO1（抑瘤环状 RNA）转染 MSC-EVs 后，MSC-EVs能将 CircDIDO1 递送至 LX-2 细胞中，内化后的 LX-2 CircDIDO1 海绵化 Lx2 细胞的 miR-143-3p，上调 Lx2 细胞PTEN 蛋白水平，降低 p-AKT/AKT 比值，以此弱化了 LX-2细胞的激活与增殖。Wnt/-catenin 信号通路被证实与 HSC 增殖、转移和 ECM 形成关系密切13。Rong 等45实验发现，人骨髓间充质干细胞（HBM-MSCs）及其来源的外泌体（HBM-MSC-Ex）通过抑制 Wnt/-catenin 信号通路（PPAR、WNT3a、WNT10b、-连环蛋白），下调该通路下游基因（WISP1、Cyclin D1）的表达，并降低-SMA+，从而减少肝星状细胞活化、增殖、迁移与 I 型胶原表达，且 HBM-MSCs-Ex效果优于 HBM-MSCs；此外，HBM-MSCs-Ex 还能影响损伤肝组织内 IL-1、IL-6 等炎症因子表达，减轻炎症反应，修复受损肝组织。这些报告表明 MSC-EV 对抗肝纤维化收效较佳；同时，MA 等44的实验结果也从侧面印证了利用 MSC-EV 对HSC 的靶向作用，将功能性 RNA 封装后精准靶向 HSC 的想法是可行的，但仍需要更多的研究支持。6 结束语 细胞外囊泡尤其是外泌体在肝纤维化的发病、进展及诊治方面意义非凡，通过转运蛋白、核酸等组分干预 HSC 活化、增殖与迁移，调控肝纤维化进程；此外，间充质干细胞相关EV，在改善肝纤维化上效果显著。但目前 EVs 对抗肝纤维化尚无标准化的治疗策略，且存在半衰期短、施用后快速清除-64-和有效载荷不足等问题，作为诊断手段，EV-miRNA 亦存在固有核酸量较低、检测手段不统一的遗憾。因此，短期内很难将基于 EVs 的肝纤维化诊断及治疗应用于临床实践。尽管如此，基于 EVs 探索肝纤维化的无细胞诊断及疗法仍是未来的研究热点和发展趋势。此外，红景天苷借用外泌体踏板干预 HSC 的迁移来牵制肝纤维化这一结果也格外瞩目。中医药作为我国医学国粹，在疾病治疗方面具有多层次、多途径、多靶点的综合药理特点，不仅是红景天苷，水飞蓟素、柴胡皂甙等抗肝纤维化作用也在实验阶段获得认可，扶正化瘀方、鳖甲软肝片更是在临床上被广泛用于治疗或缓解肝纤维化。目前关于 EVs 与中药联合应用治疗肝纤维化的研究寥寥无几，因此加大研究 EVs 与中药的作用机制，明确中医药对抗肝纤维化的作用靶点，利用 EVs 为抗纤维化的中药有效成分构建作用通道，精准给药，发挥中西医结合优势，为肝纤维化诊治开拓新方向。【参考文献】1 XU Y,FENG K,ZHAO H,et al.Tumor-derived extracellular vesicles as messengers of natural products in cancer treatmentJ.Theranostics,2022,12(4):1683-1714.2 HU Z L,LI H Y,CHANG X,et al.Exosomes derived from stem cells as an emerging therapeutic strategy for intervertebral disc degenerationJ.World Journal of Stem Cells,2020,12(8):803-813.3 LUO N,LI J,CHEN Y,et al.Hepatic stellate cell reprogramming via exosome-mediated CRISPR/dCas9-VP64 deliveryJ.Drug Delivery,2021,28(1):10-18.4 SANTUCCI L,BRUSHI M,DEL Z G,et al.Biological surface properties in extracellular vesicles and their effect on cargo proteinsJ.Scientific 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