临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班.pptx

基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所中心法则中心法则 复 转录转录 翻译翻译 DNADNA RNARNA 蛋白质蛋白质 蛋白蛋白 制制 反转录反转录 糖蛋白糖蛋白 脂蛋白脂蛋白 酶类酶类 激素激素 细胞因子细胞因子 基因重组技术基因重组技术 基因探针技术基因探针技术 基因重组药物 基因诊断 基因治疗 PKUPKU 尿毒症（口服尿毒症（口服artificial cells)artificial cells)基因诊断基因诊断 运用基因探针，PCR技术等探测特定靶基因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。基因型 表 型 基 临 血 生 细 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 诊 学 学 学 学 学 断 诊 诊 诊 诊 诊 诊 断 断 断 断 断 断基因诊断的特点基因诊断的特点灵敏度高（早期）灵敏度高（早期）特异性强特异性强操作简便操作简便取材大多不受组织器官限制取材大多不受组织器官限制可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断检测细菌内病毒等微生物时不需培养检测细菌内病毒等微生物时不需培养聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction（PCRPCR）Kary B.Mullis1984 年问世,成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑1993 荣获诺贝尔奖 Mendocin 128号公路附近一棵七叶树下的突发奇想专利官司之战:DuPont 与Cetus对薄公堂 PCR PCR 原理示意图原理示意图PCRPCR技术的应用技术的应用一、在分子生物学研究中的应用、在分子生物学研究中的应用二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断：二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断：血友病、血友病、地中海贫血、地中海贫血、DMD、PKU等等等等三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等四、病毒四、病毒五、白血病、肿瘤五、白血病、肿瘤六、骨髓移植、器官移植供体配型选择六、骨髓移植、器官移植供体配型选择七、法医学七、法医学八、动植物学八、动植物学九、古人类学、古生物学九、古人类学、古生物学 PCR原理示意图热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性4分钟，使之解为单链。退火：然后置反应混合物于55，使引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入2单位耐热的Taq DNA聚合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个PCR过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。引物延伸：置上述反应混合物于70水浴中1-2分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始,沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。接着，将上述热变性退火引物延伸（称为一个循环）反复进行30-35次。只是热变性的时间缩短为1分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍（2）。因此，如进行n次循环，则拷贝数将增加2n倍！进行25个循环，则拷贝数将增加225倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。如果引物5端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。影响PCR效果的重要因素及注意事项：PCR技术的原理似乎非常简单明了，PCR反应的操作也并不复杂；但要取得好的结果和良好的可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。以下列出影响PCR扩增效果的主要因素 引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。长度一般在18-25个碱基，Tm值可按公式（G+C总数x4）+（A+T总数x2）（）估算。尽可能避开4个以上G或C等相同碱基串联重复。尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体（Dimer）的可能性。G、C与A、T的比例尽可能1:1左右。同一反应管中的引物（甚至同一个Lab的所有引物）Tm值设计的相同。引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重PCR及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更严。基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。各种试剂小量分装保存，避免多次冻融。dNTP浓度要优化。退火温度参考Tm值进行优化。其对PCR的成败，非特异产物的出现与否关系最大。Taq DNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。对扩增难度较大的PCR，Mg2+浓度要适当增加。操作者的手法也有影响，要在实践中总结提高技术。荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较HLA分型技术HLA（人类白细胞抗原）MHC区基因（主要组织相容性复合物基因区）高度多态性的基因区HLA分型技术一、淋巴细胞微量细胞毒试验一、淋巴细胞微量细胞毒试验 1964年，年，Paul Terasaki,LA,USA二、二、DNA分型法分型法 优点：优点：1.血样不要求新鲜血样不要求新鲜;2.白血病患者白血病患者WBC表面抗原被破坏表面抗原被破坏,只只 能用能用DNA分型法分型法;3.结果更准确可靠结果更准确可靠HLA分型技术nDNA-RPLP,1982nPCR/SSOnPCR/反向斑点杂交nPCR/SSCPnPCR/SSPnPCR/SBTnR-Q-PCR/SSPnPCR/dHPLC等 在序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术基础上，将荧光定量PCR（FQ-PCR）技术与SSP结合起来，建立了自动化程度更高的荧光定量PCR-HLA分型技术，完成了46例尸肾供受者的HLA-DBR1分型。FQ-PCR不需走电泳，减少了污染的机会，提高了自动化程度。同时又开展了以DNA测序为基础的HLA分型（SBT）技术。三、主要方法：1、HLA血清学分型。2、常规PCR-SSP反应。3、SBT分型法：(1)PCR扩增DRB1片段。(2)用ABI-373型自动测序仪测序。(3)测序数据分析及分型。结果和讨论一、进行PCR-SSP法HLA-DRB1位点分型：4、荧光定量PCR技术原理：图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比n图4、15 R-II号样本荧光定量分型结果n图5、SSP分型结果与上述一致FQ-PCR分型的优点：(1)荧光定量分型法省去了电泳分析、UVP成像的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了工作量。(2)判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了PCR后处理的时间，结果更客观。(3)将引物的特异性和探针的特异性结合，提高了准确性。(4)只需在反应前打开离心管一次，即可完成所有的操作，减少了污染的机会，进一步提高了特异性和灵敏性。(5)本FQ-PCR HLA DRB1配型较常规FQ-PCR减少了合成的荧光探针数量。(6)可得出起始模板拷贝数定量结果。基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用特点：PCR技术一问世，首先就应用于珠蛋白生成障碍性贫血等遗传病的基因诊断。不但要查特定基因是否存在，而且要查出相应功能基因的缺陷：突变？缺失？插入？倒位？等等。采用的技术更复杂、多样，与检测病毒、细菌的要求不完全相同。实验室的验收。基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用技术：PCR/凝胶电泳 PCR/RFLP PCR/SSCP PCR/ASO(Allile-specific oligoprobe)PCR/sequencing ASA(Allile-specific Amplification)m-PCR(multiplex PCR)F-Q-PCR(Real-Time PCR)血友病甲基因诊断刘敬忠，梁燕，王立荣，肖白，朱章菱，周艳，刘亮，张晶 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所甲型血友病因子基因倒位的研究及检测新技术：血友病甲（HA）是常见的X-连锁遗传性出血性疾病，是由于凝血因子（F）基因缺陷所致。约半数重型HA的患者，是由于F基因第22内含子（IVS22）发生基因倒位所致。迄今，国际上检测这种基因倒位都是用Southern印迹杂交技术。虽然这种技术能够准确的查出这种基因倒位，但操作步骤多，流程长，出结果慢，难度大，需要DNA样品量大以及操作放射性同位素标记的探针等。我们从1996年开始在国际上率先研究利用长距离DNA扩增技术（LD-PCR），替代Southern杂交进行F基因倒位的诊断。经过近二年的努力终获成功，并进行了推广应用。主要完成了以下几方面工作：自行设计合成了长距离PCR的四个引物P、Q、A、B。预期扩增产物长度P/Q为12Kb，A/B为10Kb，P/B及A/Q为11Kb。四引物及三引物LD-PCR体系的比较 系统优化了引物浓度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO浓度，基因组DNA的质量和用量，退火及延伸温度、时间，低浓度琼脂糖凝胶电泳条件及操作方法等。使10-12Kb DNA扩增及检测倒位终获成功。这充分体现了该成果的科学性和先进性不同量模板不同量模板DNADNA对对LD-PCR LD-PCR 的影响的影响1-51-5号的号的DNADNA量分别为量分别为0.250.25，0.50.5，0.750.75，1.01.0，1.25g1.25g不同量不同量deaza-dNTPdeaza-dNTP对对LD-PCRLD-PCR的影响的影响1-51-5号号dNTPdNTP浓度分别为浓度分别为200200，300300，400400，500500，600M600M 53份重型HA患者及家系成员DNA标本，分别用经典的Southern印迹杂交和本LD-PCR技术在双盲条件下进行F基因倒位检测。两者得出的诊断结论完全一致。表明用LD-PCR技术诊断该基因倒位，检出携带者的特异性和灵敏度均达到百分之百。而且具有操作步骤较简便，需DNA量少，出结果快，不需操作放射性同位素标记探针，在无法取得先症者患儿血样的情况下，也可直接查携带者是否携带倒位基因，如果是可直接做产前诊断等优点。双盲实验（53份DNA）结果证明：LD-PCR可独立用于重型HA基因倒位的检测应用实验成功的LD-PCR技术，对来自北京、天津、江苏、湖北、广西、四川、山东、福建等省市的108 个重型HA患者及数目不等的家系成员进行了检测，共查出F基因倒位47例，占44%，与国际上用Southern杂交技术查出的基因倒位引起的HA约占重型HA的40-50%一致。另外，检出30余位倒位基因携带者，为将来开展产前基因诊断，杜绝新的HA患儿出生打下了基础，对优生、提高人口素质有重要意义。14个个DNA标本标本LD-PCR电泳结果电泳结果M：DNA/Hind酶解产物，三条带分别为酶解产物，三条带分别为23.1kb，9.4kb，6.6kb美国Steve.S.Sommer去年与我们同期发表了一篇类似技术方法的摘要文章。但我们较他们有两个显著不同特点：一是我们强调了运用P、Q和B这三个引物就完全可以满足诊断的需要，省去一个引物A，减少一条10Kb扩增带。这条10Kb带是多余的，且使11Kb及12Kb带出现的难度增大。二是我们研究成功方法后，立即迅速应用于患者及其家系的诊断和携带者检出，现已达一百余家系，产生了很大社会效益和一定的经济效益，并开始向兄弟单位推广应用。HA8家系家系PCR/Bcl酶解分析结果酶解分析结果M:pBR322/Msp；0:-2（酶解前）扩增带长（酶解前）扩增带长374bp，图中，图中211bp和和163bp为酶解后产物为酶解后产物M312120 HA15家系家系St14位点位点VNTR多态基因连锁分析结果多态基因连锁分析结果M:X174/Hae M 12321HA18家系内含子家系内含子13（A）和内含子）和内含子22（B）可变串联重复数目多态性分）可变串联重复数目多态性分析结果析结果A为内含子为内含子13中（中（CA）重复分型结果：）重复分型结果：-1为为21/-，-2为为21/20，-2为为22/20，-1为为21/-，-1为为21/21，她是携带者；，她是携带者；B为内含子为内含子22中中（GT）（）（AG）重复分型结果：）重复分型结果：-1为为26/-，-2为为26/26，-2为为27/26，-1为为26/25，-1为为25/-1 2 2 1 1 1 2 2 1 1血友病乙的基因诊断，携带者检出和产前诊断刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所血友病乙的基因诊断，携带者检出和产前诊断缺失型-地中海贫血基因诊断技术的改进刘敬忠，周桔，王立荣，周艳 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所临床诊断Barts（-/-/-）n基因型n临床分型静止型静止型（-/）-SEA-3.7-4.2标准型标准型（-/-/）HbH病病（-/-/-）问题：PCR技术可重复性差,难度大，结果判断复杂，引物设计有待改进 措施：1、重新设计引物 2、改进和优化PCR反应体系 酶、deaza-dGTP、DMSO、退火温度、gradient gel等 A B C A B C GE S1 S2 S3 M1 1 2 3 4 5 6 M2 7 8 9 M2 10 11 12 M31.2%/2.0%浓度梯度琼脂糖凝胶1，4，正常（/）；2，5，-3.7/；3，6，-3.7/-SEA；7，/；8，-4.2/；9，12，-4.2/-SEA；10，/；11，-SEA/-SEA；12，9，-4.2/-SEA1.58Kb287 bp173 bp1.9 Kb1.7 Kb 根据本试剂盒三个根据本试剂盒三个PCR反应产物的电泳图反应产物的电泳图谱作出基因诊断谱作出基因诊断单管四重PCR试剂盒检测-珠蛋白的基因三种缺失类型及引物设计示意图 10种DNA的四重PCR图谱25个海南黎族人DNA的扩增图谱 20个广西、广东-地贫68标本的多重PCR扩增图根据图谱作出诊断 扩增带电扩增带电电泳图电泳图 及诊断及诊断序号序号 0.8Kb 1.6Kb1.9Kb1.5Kb诊诊 断断1-+-正正常常(/);但但不不排排除除/T的可能性的可能性2-+-3.7携带者携带者(-3.7/)3-+-4.2携带者携带者(-4.2/)4-+-3.7纯合子纯合子(-3.7/-3.7)5-+-4.2纯合子纯合子(-4.2/-4.2)6-+-+-3.7/-4.2双重杂合子双重杂合子 7+-SEA/-SEA巴氏水肿胎儿巴氏水肿胎儿 8+-SEA/-3.7(缺失型缺失型HbH病病)9+-+-SEA/-4.2(缺失型缺失型HbH病病)10+-+-SEA/（-SEA携带者）携带者）-SEA/T(非缺失型非缺失型HbH病病)11-PCR失败失败,查找原因查找原因,重复作重复作 DNA的提取方法：盐析法 酚-氯仿抽提法 Chelex快速法0.8kb质粒灵敏度检测0.8kb稳定性结果稳定性结果:1#-a 3.7/-2#-a 4.2/-3#aa/-4#-a 3.7/-a 4.25#aa/-0小时 48小时 72小时 96小时31例阳性标本 29例阳性标本 60例阴性标本B7 B12，E8B11B7,B11,B12:-a 3.7/-1#1.0ul 2#2.0ul 3#3.0ul4例例可可疑疑标标本本的的鉴鉴定定206bp替代109bp 10-8=33拷贝 灵敏度206bp标准曲线灵敏度灵敏度436bp试剂盒检测结果0.2ug 0.1ug 0.05ug 0.02ug 0.01ug 平行性0小时 48小时 72小时 96小时436bp稳定性结果 1#-a 3.7/-2#-a 4.2/-3#-a 3.7/-a 4.24#-a 4.2/-a 4.25#-/-60例阳性标本及4例阴性标本1.5kb试剂盒引物优化试剂盒引物优化1#G/E+2 2#G+2/4.2R 3#G/4.2R 4#G+2/E+2SYBR-PCR/D.C.技术的优点:RealTime-PCR的优点.不需探针易优化 等