微小RNA-22-3p调控...充质干细胞心肌样分化的影响_钟晓鸣.pdf

书书书中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAEVol.45 No.11基金项目:国家自然科学基金(81770296)论著微小 NA-22-3p 调控 Kruppel 样因子 6 表达对骨髓间充质干细胞心肌样分化的影响钟晓鸣，张蕾，姚新亮，刘洪洋，张媛，万琪琳，李彦明，程冠昌河南大学淮河医院心血管内科，河南开封 475000通信作者:李彦明电话:[phone]，电子邮件:摘要:目的探究微小 NA-22-3p(mi-22-3p)调控 Kruppel 样因子6(KLF6)表达对骨髓间充质干细胞(BMSC)心肌样分化的影响。方法分离并培养大鼠 BMSC，将第 3 代 BMSC 分为对照组、5-氮杂胞苷(5-AZA)组、模拟物阴性对照组、mi-22-3p 模拟物组、mi-22-3p 模拟物+空载质粒组、mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组;实时荧光定量PC(qT-PC)检测细胞中 mi-22-3p 及 KLF6 表达;免疫荧光化学染色法检测细胞结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白T(cTnT)、间隙连接蛋白 43(Cx43)表达;Western blot 检测 Desmin、cTnT、Cx43、KLF6 蛋白表达;流式细胞术检测 BMSC 凋亡情况;采用双荧光素酶报告基因实验分析 mi-22-3p 和 KLF6 的靶向关系。结果与对照组比较，5-AZA 组 BMSC 中 mi-22-3p(q=7.971，P 0.001)、Desmin(q=7.876，P 0.001)、cTnT(q=10.272，P 0.001)、Cx43 表达(q=6.256，P 0.001)以及细胞凋亡率(q=12.708，P 0.001)显著增加，而 KLF6 mNA(q=20.850，P 0.001)及蛋白表达(q=11.080，P 0.001)显著降低;与 5-AZA 组和模拟物阴性对照组比较，mi-22-3p 模拟物组 BMSC 中 mi-22-3p(q=3.591，P 0.001;q=11.650，P 0.001)、Desmin(q=5.975，P 0.001;q=13.579，P 0.001)、cTnT(q=7.133，P 0.001;q=17.548，P 0.001)、Cx43 表达(q=4.571，P=0.037;q=11.068，P 0.001)显著增加，而 KLF6 mNA(q=7.384，P 0.001;q=28.234，P 0.001)及蛋白表达(q=4.594，P=0.036;q=15.945，P 0.001)显著降低，mi-22-3p 模拟物组细胞凋亡率显著低于 5-AZA 组(q=8.216，P 0.001);与 mi-22-3p 模拟物+空载质粒组比较，mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组 KLF6 mNA(q=23.891，P 0.001)及蛋白表达(q=13.378，P 0.001)显著增加，Desmin(q=9.505，P 0.001)、cTnT(q=10.985，P 0.001)、Cx43 表达(q=8.301，P 0.001)显著降低，细胞凋亡率增加(q=4.713，P=0.029)。双荧光素酶报告基因实验发现 KLF6 是 mi-22-3p 的潜在靶基因。结论mi-22-3p 通过抑制 KLF6 表达来促进 BMSC 心肌样分化。关键词:微小 NA-22-3p;Kruppel 样因子 6;骨髓间充质干细胞;心肌样分化中图分类号:541.9文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0001-08DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15052MicroNA-22-3p egulates the Expression of Kruppel-like Factor 6 to Affect theCardiomyocyte-like Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem CellZHONG Xiaoming，ZHANG Lei，YAO Xinliang，LIU Hongyang，ZHANG Yuan，WAN Qilin，LI Yanming，CHENG GuanchangDepartment of Cardiovascular Medicine，Huaihe Hospital，Henan University，Kaifeng，Henan 475000，ChinaCorresponding author:LI YanmingTel:0371-23906832，E-mail:ABSTACT:ObjectiveTo explore the effect of microNA-22-3p(mi-22-3p)regulating the expres-中 国 医 学 科 学 院 学 报2February，2023sion of Kruppel-like factor 6(KLF6)on the cardiomyocyte-like differentiation of bone marrow mesenchymal stemcell(BMSC)Methodsat BMSC was isolated and cultured，and the third-generation BMSC was dividedinto a control group，a 5-azacytidine(5-AZA)group，a mimics-NC group，a mi-22-3p mimics group，ami-22-3p mimics+pcDNA group，and a mi-22-3p mimics+pcDNA-KLF6 group.eal-time fluorescent quan-titative PC(qT-PC)was carried out to determine the expression of mi-22-3p and KLF6 in cells.Immuno-fluorescence staining was employed to detect the expression of Desmin，cardiac troponin T(cTnT)，and connexin43(Cx43)Western blotting was employed to determine the protein levels of cTnT，Cx43，Desmin，andKLF6，and flow cytometry to detect the apoptosis of BMSC.The targeting relationship between mi-22-3p andKLF6 was analyzed by dual luciferase reporter gene assay.esultsCompared with the control group，5-AZA up-regulated the expression of mi-22-3p(q=7.971，P 0.001)，Desmin(q=7.876，P 0.001)，cTnT(q=10.272，P 0.001)，and Cx43(q=6.256，P 0.001)，increased the apoptosis rate of BMSC(q=12.708，P 0.001)，and down-regulated the mNA(q=20.850，P 0.001)and protein(q=11.080，P 0.001)levels of KLF6.Compared with the 5-AZA group and the mimics-NC group，mi-22-3p mimics up-regulated the expression of mi-22-3p(q=3.591，P 0.001;q=11.650，P 0.001)，Desmin(q=5.975，P 0.001;q=13.579，P 0.001)，cTnT(q=7.133，P 0.001;q=17.548，P 0.001)，andCx43(q=4.571，P=0.037;q=11.068，P 0.001)，and down-regulated the mNA(q=7.384，P 0.001;q=28.234，P 0.001)and protein(q=4.594，P=0.036;q=15.945，P 0.001)levels of KLF6.Theapoptosis rate of mi-22-3p mimics group was lower than that of 5-AZA group(q=8.216，P 0.001)Com-pared with the mi-22-3p mimics+pcDNA group，mi-22-3p mimics+pcDNA-KLF6 up-regulated the mNA(q=23.891，P 0.001)and protein(q=13.378，P 0.001)levels of KLF6，down-regulated the expression ofDesmin(q=9.505，P 0.001)，cTnT(q=10.985，P 0.001)，and Cx43(q=8.301，P 0.001)，andincreased the apoptosis rate(q=4.713，P=0.029).The dual luciferase reporter gene experiment demonstra-ted that KLF6 was a potential target gene of mi-22-3p.ConclusionMi-22-3p promotes cardiomyocyte-likedifferentiation of BMSC by inhibiting the expression of KLF6.Key words:microNA-22-3p;Kruppel-like factor 6;bone marrow mesenchymal stem cell;cardiomyocyte-like differentiationActa Acad Med Sin，2023，45(1):1-8急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由冠状动脉闭塞引起的急性缺血缺氧造成不可逆的心肌细胞坏死和心脏功能障碍，是全球人类疾病死亡的主要原因之一1-2。挽救濒死心肌，恢复心脏功能是治疗 AMI 的关键，许多研究学者认为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)分化为心肌样细胞对修复梗死心肌组织具有重要作用，因此，促进 BMSC 心肌样分化对于治疗 AMI 至关重要 3。微小 NA(microNA，miNA)作为内源性的小分子非编码 NA，可通过结合靶基因信使 NA 的 3非翻译区，调节基因表达，其已被证实在细胞生理病理过程中具有重要的调控作用 4。有研究发现，mi-22 参与心脏重塑及心肌细胞肥大过程，mi-22-3p 在 AMI 小鼠中表达下调，促进其表达可改善心肌损伤2，5。此外，mi-22-3p 过表达还可促进 BMSC 成骨分化6，但关于其是否参与 BMSC 心肌样分化还未可知。Kruppel 样因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)作为 KLF 家族成员之一，参与心肌、骨骼肌、平滑肌的发育及功能调控7-8。本研究通过探究 mi-22-3p 调控 KLF6 表达对BMSC 心肌样分化的影响，为 BMSC 向心肌样细胞分化的分子机制及 AMI 治疗提供参考。材料和方法实验动物7 周龄 SPF 级健康雄性 SD 大鼠10 只(体重 235 270 g)购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号:SCXK(鲁)2019-0003。饲养于河南大学淮河医院动物房，使用许可证号:SYXK(豫)2020-0002。在温度22 24，湿度 55%65%，12 h/12 h昼夜交替环境中适应 1 周后进行实验。本研究通过河南大学淮河医院动物伦理委员会批准(伦理审批编号:20201124)。微小 NA-22-3p 调控 Kruppel 样因子 6 表达对骨髓间充质干细胞心肌样分化的影响Vol.45 No.13主要试剂和仪器DMEM 培养基(批号:D5546)购自上海辅泽商贸有限公司;5-氮杂胞苷(5-azacyti-dine，5-AZA)(批号:30046554)购自深圳海思安生物技术有限公司;兔抗-actin、肌钙蛋白 T(cardiactroponin T，cTnT)、间隙连接蛋白 43(connexin 43，Cx43)、KLF6 抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(批号:4970、5593、3512、7074)购自美国 Cell Signa-ling Technology 公司;结蛋白(Desmin)抗体(批号:ab15200)购自英国 Abcam 公司;CD90-PE-CyTM7(批号:555596)、CD29-PE(批号:555443)、CD45-FITC抗体(批号:553088)购自美国 BD Biosciences 公司;FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG(批号:115-095-003)购自美国 Jackson Immunoesearch 公司;蛋白定量试剂盒(批号:E162)购自北京康润诚业生物科技有限公司;蛋白提取试剂盒(批号:KGP250)购自江苏凯基生物技术股份有限公司;反转录试剂盒(批号:J-SP1105-50)购自上海研谨生物科技有限公司;实时荧光定量 PC(real-time fluorescent quantitative PC，qT-PC)检测试剂盒(批号:P7640L)购自苏州蚂蚁淘生物科技有限公司;Lipofectamine 2000 转染试剂盒(批号:11668019)购自北京智杰方远科技有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号:Omt-05)购自北京奥秘佳得医药科技有限公司;EXFLOW 流式细胞仪购自北京达科为生物技术有限公司;Axygen 凝胶成像系统购自广州科适特科学仪器有限公司;MA-5000 型 96 孔 qT-PC购自苏州雅睿生物技术股份有限公司;模拟物阴性对照(5CTCAACTGGTGTCGTGGA 3)、mi-22-3p 模拟物(5AAGCTGCCAGTTGAAGAACTG 3)由北京达科为生物技术有限公司合成。BMSC 分离与细胞培养将 SD 大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于 75%乙醇中，10 min 后置于超净工作台中进行股骨分离，暴露骨髓腔，用含血清培养基冲洗骨髓，收集骨髓细胞混匀，离心弃上清液后使用 5 ml 含15%胎牛血清的 DMEM 培养基重悬，接种于培养瓶中，置入 37、5%CO2恒温培养箱中培养，48 h 后光镜下观察细胞贴壁情况，每 3 d 更换 1 次培养基，待细胞融合度达 80%后，0.25%胰酶消化并进行传代，培养至第 3 代后进行后续实验，采用倒置相差显微镜观察细胞形态。大鼠心肌 H9c2 细胞采用含 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的 DMEM 培养基培养、消化和传代。BMSC 鉴定取第 3 代 BMSC 进行胰酶消化，添加常规培养基终止消化后离心(1000 r/min，r=8 cm)5 min 弃上清液，300 l PBS 重悬细胞并将细胞浓度调整为1 1010/L，取200 l 细胞悬液至EP 管中，分别添加 CD90-PE-CyTM7、CD29-PE、CD45-FITC 抗体(5 l)和同型对照抗体，混匀后避光孵育 0.5 h，流式细胞仪检测 BMSC 表面标志分子。细胞转染及分组将第 3 代 BMSC 以 1 104个/ml密度接种于6 孔板中，每孔 100 l，按照 Lipofectamine2000 转染试剂盒说明书将 mi-22-3p 模拟物及模拟物阴性对照、KLF6 过表达质粒及空载质粒转染至相应细胞中培养48 h。根据处理情况，将细胞分为6 组:(1)对照组:正常培养基培养;(2)5-AZA 组:8 mol/L 5-AZA诱导 BMSC 心肌样分化 24 h;(3)模拟物阴性对照组:转染模拟物阴性对照;(4)mi-22-3p 模拟物组:转染mi-22-3p 模拟物;(5)mi-22-3p 模拟物+空载质粒组:mi-22-3p 模拟物与空载质粒共转染;(6)mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组:mi-22-3p 模拟物与 KLF6过表达质粒共转染。qT-PC 检测细胞中 mi-22-3p 及 KLF6 表达采用 Trizol 法提取各组细胞总 NA 后进行反转录得到cDNA，再进行 qT-PC 扩增，反应程序:95 20 s、95 10 s、60 20 s 和70 10 s，40 个循环。KLF6及 mi-22-3p 分别以 GAPDH 和 U6 作为内参，采用2 Ct方法计算 KLF6 及 mi-22-3p 的相对表达水平。qT-PC 引物序列见表 1。免疫荧光化学染色法检测细胞 Desmin、cTnT、Cx43 表达将各组细胞以 1 108个/L 密度接种于 24孔板中，培养 24 h 后多聚甲醛固定，PBS 洗涤后添加0.05%Triton X-100 溶液孵育 0.5 h，使用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复后山羊血清封闭 0.5 h，分别加入Desmin、cTnT、Cx43 抗体(11000)4 孵育过夜，洗涤后加入山羊抗兔荧光二抗(1300)孵育 1 h，DAPI 染色剂避光孵育 5 min 后封片剂封片，荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况。表 1实时荧光定量 PC 引物序列名称序列(5-3)Kruppel 样因子 6上游引物:CGGACGCACACAGGAGAAAA下游引物:CGGTGTGCTTTCGGAAGTGU6上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA下游引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT微小 NA-22-3p上游引物:AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT下游引物:CAGTGCGTGTCGTGGAGTGAPDH上游引物:TCAGTGGTGGACCTGACCTG下游引物:TGCTGTAGCCAAATTCG TTG中 国 医 学 科 学 院 学 报4February，2023Western blot 检测 Desmin、cTnT、Cx43、KLF6蛋白表达收集各组细胞，使用 IPA 裂解液进行裂解提取细胞总蛋白，BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，吸取30 g 蛋白样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，低温下转至 PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白封闭 60 min，加入 兔 抗 Desmin、cTnT、Cx43、KLF6、-actin 抗体(11000)4 孵育过夜，然后加入二抗(15000)室温孵育 2 h，使用 ECL 发光试剂显影，于蛋白凝胶电泳成像仪中成像，Image J 软件分析条带灰度，计算蛋白相对表达量。流式细胞术检测 BMSC 凋亡收集各组 BMSC，PBS 洗涤 2 次，添加 500 l 缓冲液重悬细胞，依次加入10 l AnnexinV-FITC 染色液避光孵育15 min 及 PI 染色液避光孵育10 min 后，于流式细胞仪中检测BMSC 凋亡情况。双荧光素酶报告基因实验分析 mi-22-3p 和 KLF6的靶向关系使用 TargetScan 数据库(https:/www.targetscan.org/vert_72/)进行 mi-22-3p 和 KLF6 结合位点分析，经 qT-PC 扩增 KLF6 3-UT 片段来构建野生型 KLF6 表达载体(pGL3-KLF6-wt)，并根据位点定向突变试剂盒说明书构建突变型 KLF6 表达载体(pGL3-KLF6-mut)，分别与 mi-22-3p 模拟物和模拟物阴性对照共转染至 BMSC 中，分为 4 组:pGL3-KLF6-wt+mi-22-3p 模拟物组、pGL3-KLF6-wt+模拟物阴性对照组、pGL3-KLF6-mut+mi-22-3p 模拟物组、pGL3-KLF6-mut+模拟物阴性对照组，48 h 后弃培养基，使用 200 l 细胞裂解液将细胞裂解，离心后取上清液，使用双荧光素酶试剂盒染色，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值来表示荧光素酶相对活性。统计学处理采用 SPSS 23.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以均数 标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，并采用 SNK-q 检验进行两两比较。P 0.05 为差异有统计学意义。结果BMSC 形态观察及鉴定BMSC 在培养初期呈圆形、并处于悬浮状态;72 h 细胞呈短梭形、三角形，突起向外延伸;7 d 细胞体积增大、呈扁平状;第3 代 BMSC 形态呈较为均一的纺锤形，旋涡状或平行样分布。流式细胞术检测细胞表面抗体 CD29(95.97%)、CD90(97.82%)呈高表达，而 CD45(2.01%)呈低表达(图 1)。BMSC 和 H9c2 细胞 mi-22-3p 的表达水平qT-PC 检测结果显示，与 BMSC 比较，H9c2 细胞中 mi-22-3p 表达显著增加(1.86 0.12 比 1.00 0.00;t=15.065，P 0.001)。不同处理后 BMSC 中 mi-22-3p 及 KLF6 的表达水平与对照组比较，5-AZA 组 mi-22-3p 表达显著BMSC:骨髓间充质干细胞A.倒置光学显微镜观察细胞形态;B.流式细胞术检测细胞表面标志分子图 1BMSC 形态观察及鉴定微小 NA-22-3p 调控 Kruppel 样因子 6 表达对骨髓间充质干细胞心肌样分化的影响Vol.45 No.15增加(1.91 0.21 比 1.00 0.00;q=7.971，P 0.001)，而 KLF6 mNA(0.52 0.03 比 1.00 0.00;q=20.850，P 0.001)及蛋白表达(0.59 0.07 比1.49 0.09;q=11.080，P 0.001)显著降低;与5-AZA组和模拟物阴性对照组比较，mi-22-3p 模拟物组mi-22-3p 表达显著增加(2.32 0.34 比 1.91 0.21;q=3.591，P 0.001 和2.32 0.34 比0.99 0.08;q=11.650，P 0.001)，而 KLF6 mNA(0.35 0.03 比0.52 0.03;q=7.384，P 0.001 和 0.35 0.03 比1.00 0.05;q=28.234，P 0.001)及蛋白表达(0.38 0.07 比 0.59 0.07;q=4.594，P=0.036 和 0.38 0.07 比 1.51 0.28;q=15.945，P 0.001)显著降低;与 mi-22-3p 模拟物+空载质粒组比较，mi-22-3p模拟物+KLF6 过表达质粒组BMSC 中KLF6 mNA(0.89 0.10 比 0.34 0.04;q=23.891，P 0.001)及蛋白表达(1.33 0.27 比 0.39 0.06;q=13.378，P 0.001)显著增加(图 2)。不同处理后 BMSC 中 Desmin、cTnT、Cx43 的表达水平与对照组比较，5-AZA 组 Desmin(1.42 0.21 比0.84 0.10;q=7.876，P 0.001)、cTnT(1.15 0.18 比0.43 0.05;q=10.272，P 0.001)、Cx43 表达(1.55 0.20 比 1.03 0.12;q=6.256，P 0.001)显著增加;与 5-AZA 组和模拟物阴性对照组比较，mi-22-3p 模拟物组 Desmin(1.86 0.22 比 1.42 0.21;q=5.975，P 0.001 和 1.86 0.22 比 0.86 0.09;q=13.579，P 0.001)、cTnT(1.65 0.20 比1.15 0.18;q=7.133，P 0.001 和 1.65 0.20 比0.42 0.07;q=17.548，P 0.001)、Cx43 表达(1.93 0.18 比 1.55 0.20;q=4.571，P=0.037 和 1.93 0.18 比 1.01 0.18;q=11.068，P 0.001)显著增加;与 mi-22-3p 模拟物+空载质粒组比较，mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组 Desmin(1.16 0.11 比1.86 0.20;q=9.505，P 0.001)、cTnT(0.87 0.10 比KLF6:Kruppel 样因子 6;5-AZA:5-氮杂胞苷;Mr:相对分子质量图 2Western blot 检测不同处理后 BMSC 中 KLF6 蛋白表达1.64 0.24;q=10.985，P 0.001)、Cx43 表达(1.21 0.16 比 1.90 0.25;q=8.301，P 0.001)显著降低(图 3)。mi-22-3p 及KLF6 过表达对 BMSC 凋亡的影响与对照组比较，5-AZA 组 BMSC 凋亡率显著增加 (59.01 10.34)%比(23.39 4.18)%;q=12.708，P 0.001;与5-AZA 组比较，mi-22-3p 模拟物组细胞凋亡率显著降低 (35.98 5.20)%比(59.01 10.34)%;q=8.216，P 0.001;与模拟物阴性对照组比较，mi-22-3p 模拟物组细胞凋亡率显著增加 (35.98 5.20)%比(22.12 5.81)%;q=4.945，P=0.020;与 mi-22-3p 模拟物+空载质粒组比较，mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组细胞凋亡率显著增加 (49.22 5.07)%比(36.01 4.98)%;q=4.713，P=0.029(图 4)。mi-22-3p 靶向 KLF6 调控其表达通过 TargetScan网站查询发现，mi-22-3p 和 KLF6 之间存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验分析显示，与 pGL3-KLF6-wt+模拟物阴性对照组比较，pGL3-KLF6-wt+mi-22-3p模拟物组荧光素酶相对活性显著降低(0.45 0.05 比0.91 0.09;t=9.991，P 0.001);而 pGL3-KLF6-mut+mi-22-3p 模拟物组和 pGL3-KLF6-mut+模拟物阴性对照组之间差异无统计学意义(0.87 0.09 比 0.88 0.10;t=0.166，P=0.872)。讨论AMI 可导致心肌细胞死亡，由于成熟心肌细胞缺乏再生能力，损伤后难以自我修复。而 BMSC 具有自主分化能力，将其移植到受损心肌组织中，可通过分化为心肌样细胞来修复受损的心肌组织4，9-12。5-AZA是诱导 BMSC 心肌样分化的有效制剂，但具有一定的细胞毒性，因此，有必要对 BMSC 心肌样分化机制进行探讨，以寻找新的更为安全的方法13。本研究分离培养大鼠 BMSC，经鉴定 BMSC 表面抗体 CD29、CD90高表达，而 CD45 低表达，表明实验获得高纯度 BMSC，可用于后续实验。miNA 是一种小分子非编码 NA，已被证实与心房颤动、心肌病、心肌梗死、心力衰竭等心脏疾病有关14。mi-22-3p 广泛表达于肌肉组织中，可通过调控炎症反应、氧化应激、细胞凋亡参与多种心血管疾病的发生15-16。有研究显示，mi-22-3p 可通过负向调控肥胖相关基因表达来促进 BMSC 成骨分化6。本研究结果显示，5-AZA 及 mi-22-3p 过表达可显著增中 国 医 学 科 学 院 学 报6February，2023Desmin:结蛋白;cTnT:肌钙蛋白 T;Cx43:间隙连接蛋白 43图 3免疫荧光化学染色法(A)和 Western blot(B)检测各组 BMSC 中 Desmin、cTnT、Cx43 蛋白表达微小 NA-22-3p 调控 Kruppel 样因子 6 表达对骨髓间充质干细胞心肌样分化的影响Vol.45 No.17图 4流式细胞术检测各组 BMSC 凋亡加 BMSC 中 Desmin、cTnT、Cx43 的表达及细胞凋亡率，且与5-AZA 相比，mi-22-3p 过表达促进 Desmin、cTnT、Cx43 表达的作用更显著，但对细胞凋亡的影响相对较小。Desmin、Cx43 及 cTnT 是公认的心肌特异性蛋白，其中，Desmin 是肌细胞重要组成成分，在核膜连接及信号传导中发挥重要作用13，17-19。本研究结果表明，5-AZA 及 mi-22-3p 过表达可促进 BMSC 心肌样分化，并且 mi-22-3p 过表达促 BMSC 心肌样分化能力更强，细胞毒性作用更弱，其有作为促 BMSC心肌样分化作用靶点的潜能。双荧光素酶报告基因实验分析发现 KLF6 是 mi-22-3p 的潜在靶基因。KLF 是一类能够结合多种特异性蛋白的转录因子，参与动物和人骨骼肌、心肌的发育及功能调控 8。KLF6 作为锌指转录因子家族成员之一，主要表达于骨髓细胞，参与心脏的发育 20-21。此外，KLF6 还参与心脏重塑、内外部刺激的响应等病理过程。研究发现，KLF6 低表达可通过促进心肌细胞中细胞外基质因子、血小板反应蛋白4 的表达来抑制心脏纤维化 21。本研究结果显示，5-AZA 及mi-22-3p 过表达可显著降低 BMSC 中 KLF6 的表达。因此，mi-22-3p可能通过靶向抑制 KLF6 的表达来促进 BMSC 心肌样分化。为了验证这一结论，本研究在 mi-22-3p 过表达的基础上过表达 KLF6，结果发现 KLF6 过表达可减弱 mi-22-3p 过表达的促 BMSC 心肌样分化的作用。综上，本研究结果表明，mi-22-3p 通过抑制KLF6 表达来促进 BMSC 心肌样分化，其有作为促 BMSC心肌样分化作用靶点的潜能。本研究为 BMSC 在 AMI治疗中的应用提供了实验数据支持，后续还将对 mi-22-3p 的下游调控机制进行深入探究。参考文献 1 Yan X，Hou J.Mi-22 host gene enhances nuclear factor-kappa b activation to aggravate hypoxia-induced injury in AC16cardiomyocytes J Cell Transplant，2021，30(1):963689721990323.DOI:10.1177/0963689721990323.2 Li H，Zhang P，Li F，et al.Plasma mi-22-5p，mi-132-5p，and mi-150-3p are associated with acute myocardial infarc-tion J Biomed es Int，2019，2019:5012648.DOI:10.1155/2019/5012648.3 李娇，吕洋，刘洋，等.成纤维细胞生长因子 2 和丹参酮A 在大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用 J 解剖学报，2020，51(4):520-527.DOI:10.16098/j.issn.0529-1356.2020.04.008.中 国 医 学 科 学 院 学 报8February，2023 4 张文才，宫俊龙，杨帆，等.mi-148a 通过靶定 DNMT1调节大鼠间充质干细胞向心肌细胞的分化 J 武汉大学学报(医学版)，2019，40(1):11-16.DOI:10.14188/j.1671-8852.2018.0447.5 Wang L，Wang L，Wang Q.Constitutive activation of theNEAT1/mi-22-3p/Ltb4r1 signaling pathway in mice withmyocardial injury following acute myocardial infarction J Aging(Albany NY)，2021，13(11):15307-15319.DOI:10.18632/aging.203089.6 Zhang X，Wang Y，Zhao H，et al.Extracellular vesicle-en-capsulated mi-22-3p from bone marrow mesenchymal stemcell promotes osteogenic differentiation via FTO inhibition J Stem Cell es Ther，2020，11(1):227.DOI:10.1186/s13287-020-01707-6.7 Yu L，Zheng WJ，Li 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