免疫学E玫瑰花环形成实验.pptx

实验三实验三 E玫瑰花环形成实验玫瑰花环形成实验玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E玫瑰花环，以资鉴别实验目的练习取外周血练习取外周血熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMCPBMC）的分离方法）的分离方法学习学习E E花环试验的操作方法花环试验的操作方法观察显微镜下观察显微镜下E E花环的形态花环的形态实验原理本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为，粒细胞为1.092，淋巴细胞为，淋巴细胞为1.0740.001），利用比重介），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。不同的独立带，从而达到分离的目的。实验原理人人 T淋巴细胞表面的淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。应用最广的有总应用最广的有总E花环试验花环试验(Et,t为为total的缩写的缩写)和活性和活性E花环试验花环试验(Ea,a为为active 的缩写的缩写)。Et代表被检标本中代表被检标本中T淋巴细胞的总数淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的体的T细胞数细胞数,这部分这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。细胞免疫功能和动态变化。实验原理 E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。治提供免疫学方面的重要参考。实验原理T细胞SRBCE受体（CD2)SRBC受体nE E玫瑰花环实验玫瑰花环实验判断细胞免疫功能判断细胞免疫功能TBTT T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰花结电镜照片花结电镜照片T T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰花结示意图花结示意图实验步骤1.抽抽取人外周血取人外周血2ml置于肝素抗凝管中，再置于肝素抗凝管中，再加加2ml的的Hangs液稀释（动作要快）；液稀释（动作要快）；2.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰面清晰（动作缓慢），以（动作缓慢），以2000rpm 离心离心20分钟，分钟，离心后分为离心后分为4层层。3.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层（灰白层）至一刻度离心处淋巴细胞层（灰白层）至一刻度离心管内。管内。4.加入加入3ml的的Hanks液吹打混匀，液吹打混匀，1000rpm离心离心10分钟，弃上清，沉淀主要为淋巴分钟，弃上清，沉淀主要为淋巴细胞细胞。稀释的血液分离液离心稀释的血液分离液稀释的血浆单个核细胞分层液粒细胞、红细胞实验步骤5，取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1RBC悬液，1000rpm离心5min，取出.6，用手指轻弹试管来轻悬沉淀（不能吹打），取一滴滴加在载玻片上，显微观察。人静脉取血四个同学一组；严格无菌操作（消毒由中心想外周，半径2-3cm，手不能碰触针头金属部分）；绑好止血带（肘上5-6cm，两端向上）右手持注射器刺入静脉（枕头斜面向上成15-30角，扎入后平行前进），徐徐抽取血液，达所需量时，拔出针头，用无菌棉球压迫止血。静脉血立即注入肝素管中（除去针头后再向试管加血，防止细胞破坏）。实验结果计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算活性E花环形成率，正常值为50%-80%。E花环形成率 形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数（形成花结+未形成花结）100%Et（总E花环：放入4冰箱中过夜8h后的结合率）：60%-80%Ea（活性E花环：能立即与绵羊红细胞结合的，活性较强）：25%-40%实验结果实验结果T T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰花结光镜照片花结光镜照片分析讨论1.你的实验结果怎样？请加以分析。2.能否用涂片法来观察RE花环形成情况？为什么？