重组DNA技术20110413-分子生物学.pptx

重组重组DNA技术技术(DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆)DNA Recombination Technique(DNA Cloning or Molecular Clone)第二章第二章1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验:从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌重组重组DNA技术的发展史技术的发展史O.T.Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA；1953年,Watson和Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型1958年,Meselson和Stahl证实了DNA的半保留复制同年，Crick提出遗传信息传递的“中心法则”1961年，F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型1966年，Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码1972年，P.Berg等率先完成DNA体外重组(诺贝尔化学奖)1973年，S.Cohen等进一步实现了重组DNA的转化1977年 美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年，第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1982年，美国FDA批准首例基因工程产品-人胰岛素1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg-5050万只羊脑万只羊脑基因工程9 9升大肠杆菌升大肠杆菌 培养液相关概念相关概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因载体基因载体基本原理基本原理 重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系主要内容：主要内容：第一节第一节、重组、重组DNA技术相关概念技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology克隆克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）是在体体外外将不同来源的特特异异基基因因或或DNADNA片片段段插入病毒、质粒或其它载载体体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受受体体细细胞胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛筛选选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子(recombinant DNA,chimera DNA），即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆（DNA cloning）。DNA克隆克隆生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因克实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNADNA工艺学工艺学或或重组DNA技术技术(recombination DNA technique)(recombination DNA technique)，基因操作，基因操作(gene manipulation)(gene manipulation)、遗传工程、遗传工程(genedc engineering)(genedc engineering)。(二二)目的基因目的基因进行DNA重组的目的主要有两方面：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或使我们感兴趣的基因或DNA序列序列就是目的基因(targetDNA)。目的基因有两种类型：cDNA(complementaryDNA):在体外经反转录合成的与mRNA互补的DNA。基因组DNA(GenomicDNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。(三三)载体载体一.表达载体(expressionvector):为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。二.克隆载体(Cloningvector):为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设序列被扩增而特意设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体。第二节第二节 重组重组DNA技术操作的基本过程技术操作的基本过程基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第三节第三节 重要的工具酶重要的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基一一.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识别位点或其周围切割双链识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定义：定义：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类：型限制性核酸内切酶的作用特点型限制性核酸内切酶的作用特点回文结构回文结构(palindrome)大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成的特定序列。型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意为顺读和倒读都一样的词语切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功异源酶：同功异源酶：有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶二、二、DNA连接酶连接酶(基因工程的基因工程的“缝纫针缝纫针”)：1.T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导2.大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接三、三、DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。Klenow片段具有二种酶活性（去除53外切酶活性）。2.TaqDNA聚合酶:耐热（75-80），分子量65kD,也具53外切酶活性。反转录酶(RDDP):多功能酶，无35DNA外切酶活性，具有35RNA外切酶活性。工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第四节第四节 常用载体常用载体 定义定义载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件:具有自主复制能力具有自主复制能力有多个单一限制性内切酶的酶切位点（有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS）具有选择性遗传标记具有选择性遗传标记分子量小分子量小拷贝数高（拷贝数高（10个个200个个/细胞）细胞）具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。常用载体常用载体:质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNAEcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19质粒载体图 1.1.质粒质粒(plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNADNA，能独立进行复制。能独立进行复制。特点特点:1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高的拷贝数。主复制；有较高的拷贝数。2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。常用质粒载体常用质粒载体（一）（一）pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于，便于重组体细胞的筛选。重组体细胞的筛选。1.抗药性标记选择抗药性标记选择（二）（二）pUC系列载体系列载体:由由pBR质粒与质粒与M13噬菌体构建而成，长度为噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：，特点：具有更小的分子量和更高的拷贝数。具有更小的分子量和更高的拷贝数。“蓝蓝白白斑斑”筛筛选选:pUC载载体体中中的的LacZ基基因因可可编编码码-半半乳乳糖糖苷苷酶酶（-Gal）N端端的的-肽肽链链，该该-肽肽与与宿宿主主细细胞胞(如如E.coli JM109）中中F因因子子上上的的LacZ M15基基因因（-肽肽缺缺陷陷型型）的的产产物物互互补补，产产生生完完整整的的、有有活活性性的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶，分分解解生生色色底底物物（X-gal）形形成成蓝蓝色色菌菌落落。当当外外源源基基因因插插入入MCS后后，LacZ-肽肽基基因因的的读读码码框框被被破破坏坏，不不能能合合成成完完整整的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶分分解解底底物物X-gal，菌菌落落呈呈白白色色。称称为为“蓝蓝白白斑斑”筛筛选。选。EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19质粒载体图 3根据根据-半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选:标志补救标志补救标志补救标志补救lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal第五节第五节 目的基因的获取和体外重组目的基因的获取和体外重组1.1.化学合成法：化学合成法：较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp）2.2.基因组基因组DNADNA文库文库(genomic DNA library)(genomic DNA library)3.3.cDNAcDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)4.4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)(polymerase chain reaction,PCR)一一.目的基因的获取目的基因的获取:1.1.化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp）用途：用途：PCRPCR引物引物,测序引物测序引物,定点突变定点突变,核酸杂交探针核酸杂交探针组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2.从基因组从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因基因组基因组DNA(genomic DNA):指代表一个细胞或生指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有物体整套遗传信息的所有DNA序列序列构建基因组DNA文库的基本过程mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3.从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T TcDNA:指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA(mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单互补的单链链DNA。以单链。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNA基因组文库和cDNA文库的比较PCR技术的基本过程模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶循循环环仪仪9494oC5949455 55 72 72 4.PCR4.PCR技术获取目的基因技术获取目的基因技术获取目的基因技术获取目的基因:二二.外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接:体外重组体外重组DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接1.粘性末端连接粘性末端连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连2.2.平端连接平端连接DNA连接酶同聚物尾巴同聚物加尾法连接重组DNA分子 3.3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接:在末端转移酶的作用下，在在末端转移酶的作用下，在DNADNA片段末端加上同片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。利用人工合成的接头连接重组DNA分子4.4.人工接头人工接头(linker)(linker)连接连接:由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接5.T-A克隆T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。一、重组一、重组DNADNA分子的导入分子的导入选定的受体细胞应具备的条件：1.易于接纳重组DNA分子导入；2.对载体的复制、扩增和表达无严格限制；3.不存在特异性降解外源DNA的酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表型特征。常用的导入方法常用的导入方法:（一）转化（transformation）（二）转染（transfection）（三）感染（infection）第六节第六节 重组重组DNA分子的导入和筛选与鉴定分子的导入和筛选与鉴定转化方法：转化方法：1.氯化钙法：氯化钙法：细菌处于低温、细菌处于低温、低渗低渗CaCl2溶液中，菌细胞溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组球形，经短暂热休克后重组DNA易进入易进入2.电穿孔法：电穿孔法：除特殊仪器外除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。浓度等参数。特殊处理受体细胞细胞膜特性改变（一）转化（一）转化（transformationtransformation）CaCl2处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌（二）转染（二）转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿电穿孔孔:操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。脂质体转染脂质体转染:脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。显微注射显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达（三）感染（infection）感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组体DNA，经体外包装体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞。感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂的体外包装过程。(一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1根据载体的抗药性标记筛选 2根据载体的抗药性标记插入失活选择3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 4根据插入的外源基因性状进行筛选(二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法（六）（六）DNADNA序列检测序列检测：二二.重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定1.抗药性标记选择抗药性标记选择AmprTetrBamH位点BamH酶切BamH酶切DNA连接酶目的DNA重组质粒大肠杆菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板 2.抗药性标记插入失活选择3根据根据-半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选:标志补救标志补救标志补救标志补救lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal4根据插入的外源基因性状进行筛选如把酵母基因组DNA随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸缺陷型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸的培养基中培养。这样只有含酵母组氨酸基因并获得表达的转化菌才能在无组氨酸的培养基中生长。（二）.限制性核酸内切酶酶切鉴定凝胶电泳检测加样孔DNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段原位杂交原位杂交（三）.核酸分子杂交法:菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法（四）.PCR法某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增。如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出（五）（五）.免疫化学检测法免疫化学检测法（六）（六）.DNA.DNA序列检测序列检测ACTGAAGGCT标准：选择标志，强启动子标准：选择标志，强启动子 ，翻译调控序列，多接头，翻译调控序列，多接头克隆位点克隆位点外源基因在原核细胞中的表达：外源基因在原核细胞中的表达：1 1融合型表达蛋白融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的所谓融合型表达是指将外源目的基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表达。基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表达。2 2非融合型表达蛋白非融合型表达蛋白 3 3分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白 利用分泌型表达载体，需要在信利用分泌型表达载体，需要在信号肽的帮助下进行。号肽的帮助下进行。4 4包涵体包涵体 1.原核表达体系原核表达体系第七节第七节 克隆基因的表达克隆基因的表达E.coli表达体系的不足：表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)；很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达载体大多是穿梭载体,通常包括以下元件：1启动子包括SV40、CMV、RSV及LTR等。2增强子3剪接信号4终止信号和PolyA化信号5遗传选择标记：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。新霉素抗性选择系统新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真核细胞。重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交一、一、A型题：型题：1以质粒为载体，将外源基因导入受体菌的过程称为：A转化B转染C转导D转位E感染2最常用的筛选转化细菌是否含有质粒的方法是：A营养互补筛选B抗药性筛选C免疫化学筛选D原位杂交筛选ESouthern印迹筛选3.互补筛选属于：A抗药性标志筛选B酶联免疫筛选C标志补救筛选D原位杂交筛选E免疫化学筛选4.溶原菌是指：A整合了噬菌体基因组的细菌B整合了质粒基因组的细菌C含有独立噬菌体基因组的细菌D含有独立质粒基因组的细菌E含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌5理想的宿主细胞不应有下列哪种特点：A易接纳重组子B对载体的复制扩增无严格限制C不存在特异的限制酶体系以降解外源DNAD不对外源DNA进行修饰E含有载体的筛选标记6有关重组体转化及表达的叙述，错误的是：A宿主细胞经CaCl2处理后对重组体的通透性增加B电击法也可增加宿主细胞的通透性C噬菌体为载体的重组体必须以体外包装的方式转化宿主细胞D真核基因难于在原核细胞中表达E转化生殖细胞可采用直接导入的方法7.互补筛选属于：A抗药性标志筛选B酶联免疫筛选C标志补救筛选D原位杂交筛选E免疫化学筛选8.基因工程的操作程序可简单的概括为：A将重组体导入宿主细胞并筛选B限制酶的应用C将载体和目的基因接合成重组体D目的基因和载体的分离提纯与鉴定E分、切、接、转、筛9.重组DNA的筛选与鉴定不包括哪一方法 A.限制酶酶切图谱鉴定 B.PCR扩增鉴定 C.显微注射 D.蓝白筛选 E.抗药筛选10.直接针对目的DNA进行筛选的方法是 A青霉素抗药性 B氨卞青霉素抗药性 C分子杂交 D分子筛 E电泳11下列那项不能作为表达载体导入真核细胞的方法？A磷酸钙转染 B电穿孔 C脂质体转染 D显微注射 E氯化钙转染12下列那项不能作为基因工程重组体的筛选方法 A 抗药性标志选择 BPCR技术 C原位杂交 DSouthern印迹 E siRNA二、名词解释1.转化2.转染3.感染4.转导5.-互补（alphacomplementatlon）6.感受态细胞（competentcell）7融合型表达8.非融合型表达蛋白三、问答题、问答题1,简述互补筛选重组体质粒细菌的原理？2.试述G418筛选稳定表达细胞系原理？3.重组DNA分子导入受体细胞的方法有哪些？4.制备感受态细胞的原理是什么？目前最常用的感受态细胞制备方法是什么？5.基因工程中重组体筛选与鉴定的方法有那些？