1、PCR扩增技术扩增技术DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体Sanger的测序技术引物引物DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 207272949494945555PCR
2、PCR循环循环循环循环一、一、PCRPCR的基本原理的基本原理 PCRPCR技术实际上是技术实际上是DNADNA的体外扩增技术。的体外扩增技术。其原理类似于其原理类似于DNADNA在体内的复制过程。在体内的复制过程。只要提供一个合适的条件只要提供一个合适的条件模板模板DNADNA、寡核苷酸引、寡核苷酸引物、物、DNADNA聚合酶、四种聚合酶、四种dNTPdNTP原料和合适的缓冲液体系，原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成DNADNA的体外合成。的体外合成。PCRPCR反应是一个重复进行的反应是一个重复进行的DNADNA复制
3、过程，需要重复复制过程，需要重复进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、DNADNA聚合酶催化新链聚合酶催化新链DNADNA的合成。的合成。这这些些过过程程都都是是通通过过控控制制温温度度来来实实现现的的，即即通通过过改改变变温温度度引引 起起 变变 性性（denaturedenature）、退退 火火（annealingannealing）和和 延延 伸伸（extensionextension），），使使DNADNA得以复制。得以复制。1 1、变性、变性通通过过加加热热至至95左左右右，使使DNA双双螺螺旋旋的的氢氢键键断断裂裂，形形成成单链单
4、链DNA，作为反应的模板。，作为反应的模板。2 2、退火、退火将将温温度度降降至至引引物物的的Tm值值左左右右或或以以下下（比比Tm低低5，通通常常为为5565），引引物物与与DNA模模板板互互补补结结合合，形形成成杂杂交交链。链。3 3、延伸、延伸在在DNA聚合酶（一种耐热的聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的作用下，聚合酶）的作用下，于于7074以引物以引物3端端为起始点按为起始点按53方向使方向使DNA新链延伸。新链延伸。上上述述三三步步为为一一个个循循环环，每每一一循循环环的的产产物物作作为为下下一一个个循循环环的的模模板板，如如此此经经过过2530个个循循环环，可可使使新新生生的的DN
5、A片段得以扩增片段得以扩增1069倍（至少扩增倍（至少扩增105 倍）。倍）。PCR的反应原理也就是的反应原理也就是PCR的基本过程。的基本过程。1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍复性（退火）复性（退火）延伸延伸变性变性复性（退火）复性（退火）延伸延伸变性变性 复性复性（退火）（退火）延延伸伸1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶
6、抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加http:/
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