Hb的醋酸纤维薄膜电泳.pptx

电泳电泳：指带电胶体粒子或分子在电场的指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。作用下，作定向移动。由于各种物质分子由于各种物质分子的等电点不同在同一的等电点不同在同一P环境中所带的电环境中所带的电荷各不相同荷各不相同,再由于分子量、分子结构、形再由于分子量、分子结构、形状大小各有差异，因此在同一电场中泳动状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度也就不一样。一般来说，所带的电荷速度也就不一样。一般来说，所带的电荷多而分子量小、形状越接近球形者，泳动多而分子量小、形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。速度快，反之则慢。电泳技术的分类：主要归纳为；1）显微电泳显微电泳即在显微镜下观即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。胞电泳。2）自由电泳自由电泳即悬浮在介质中即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在电场作用下的细胞和生物大分子，在电场作用下自由定向移动。自由定向移动。3）区域电泳区域电泳（区带电泳）：即在（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接分不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自电离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子或分子形成各自区荷差异的生物粒子或分子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类胶等，此类 电泳技术分离技巧简便，电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。运用十分广泛。4）免疫电泳免疫电泳：即抗原与抗体在比：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。电免疫技术，亲和电泳即属此类。根据缓冲液的性质不同可分为：1.1.连续系统：连续系统：电泳缓冲液的离子成分、电泳缓冲液的离子成分、PHPH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有带电颗粒电泳时仅具有电荷效应电荷效应、分子筛分子筛效应效应。2.2.不连续系统：不连续系统：电泳缓冲液离子成分、电泳缓冲液离子成分、pHpH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有相同，带电颗粒电泳时具有浓缩效应浓缩效应、电电荷效应荷效应、分子筛效应分子筛效应。血红蛋白（血红蛋白（Hb)的组成及分类：的组成及分类：血红蛋白（血红蛋白（Hb)：由：由亚铁血亚铁血红素红素、珠蛋白珠蛋白 组成组成 。每个珠蛋白分。每个珠蛋白分子由子由4条多肽链构成条多肽链构成 ，根据其一级结，根据其一级结构的不同可分为构的不同可分为、四种类型。四种类型。正常成人Hb种类：组成 百分含量 pIHbA 22 9598%6.95HbA2 22 23%7.38HbF 22 6.95 实验原理实验原理(Experimental Principles)在pH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 8.6），在电场中向正极泳动。电泳时，由于各种Hb等电点不同，所带电荷量不同；分子量大小、形状不同，导致各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。醋酸纤维素薄膜是由纤维素醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳得到分有生物活性物质均能通过电泳得到分离。离。醋酸纤维素薄膜电泳因设备醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方量等，已成为临床、实验室首选的方法法。实验材料、主要仪器和试剂实验材料、主要仪器和试剂（Equipments,Materials and Agents）1、试剂、试剂 0.9%0.9%的的NaClNaCl溶液；蒸馏水；溶液；蒸馏水；四氯化碳；碘四氯化碳；碘酊；酊；75%75%酒精；酒精；TEBTEB缓冲液（缓冲液（pH8.6pH8.6）；丽春）；丽春红染液；漂洗液。红染液；漂洗液。2、实验器材、实验器材 醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；消毒棉签。针；消毒棉签。操作步骤操作步骤（Operating Procedure）1.1.取血：取血：用用2%2%碘酊棉球消毒受试者手指，再用碘酊棉球消毒受试者手指，再用75%75%酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约0.05ml0.05ml放入放入事先已加入事先已加入0.9%NaCl 1ml0.9%NaCl 1ml 的的1.5ml1.5ml离心管中。如出血不畅，可对手指稍离心管中。如出血不畅，可对手指稍加挤压。加挤压。2.2.制备制备HbHb液：液：1 1）洗涤红细胞洗涤红细胞：将上述离心管，颠倒混：将上述离心管，颠倒混匀匀5-65-6次，次，4000rpm4000rpm，离心，离心3 3分钟。弃上分钟。弃上清，再加清，再加1ml 0.9%NaCl1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞，悬浮红细胞，相同条件重复离心一次。相同条件重复离心一次。2 2）溶血溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1 1 2 2滴，摇匀，再加入四氯化碳滴，摇匀，再加入四氯化碳1 1滴，滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得上清即得HbHb液。液。3.3.电泳电泳1 1）膜条准备：）膜条准备：2 2）点样：）点样：取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，然后平铺液体，然后平铺,（毛面朝上毛面朝上），用小玻片沾取），用小玻片沾取适量适量HbHb液，按印于点样线上，点样处液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘离膜条边缘1.5cm1.5cm左右左右。3 3）电泳：）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，盖严电泳室。通向下，上样一端靠近负极，盖严电泳室。通电预电泳电预电泳5-10min5-10min。调节电压为。调节电压为100V100V，电泳，电泳303040分钟。分钟。4 4）染色：）染色：电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，放在丽春红染色液中染色放在丽春红染色液中染色1010分钟。分钟。5 5）漂洗：漂洗：取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗至凝胶背景无色为止。至凝胶背景无色为止。结果与分析：结果与分析：（Results and Analysis）观察膜条上观察膜条上HbHb条带的位置及颜色的深浅。条带的位置及颜色的深浅。绘图纪录之。绘图纪录之。临床意义异常血红蛋白：指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加，造成血红蛋白结构及功能异常，导致一系列病理和生理改变。是常见的遗传病之一是常见的遗传病之一.人类异常血红蛋白高达两千多种类型，约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此，在临床上快速、早期诊断尤为重要。血红蛋白病分类1.异常Hb病：基因突变导致珠蛋白结构改变.例如：镰状红细胞贫血.形成原因：链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS（镰状Hb)取代了正常的Hb。在缺氧情况下，HbS聚合形成长棒状聚合物，使红细胞镰变,变形能力低，导致溶血、贫血，引起血粘度增高，血管梗阻性继发症状。发病的分子基础是：链基因的一个碱基对GAG变为GTG，致使血红蛋白的链N端第6位的谷氨酸被缬氨酸取代形成HbS。2.地中海贫血：基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏或合成量异常，如、地贫。地中海贫血是由于，珠蛋白基因缺失、突变导致某种珠蛋白链合成障碍，造成链和链合成数量不平衡，引起的溶血性贫血。最初发现在地中海地区居住的人群发病率特别高，因而称为地中海贫血。实际上世界各地都有发生，非洲和东南亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。血红蛋白病特点：b；都表现为低色素性贫血。