PCR扩增基因.pptx

PCR 原理原理】n n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是是一种一种选择性体外扩增选择性体外扩增DNADNA的方法的方法，其基本原理类，其基本原理类似于似于DNADNA的天然复制过程。的天然复制过程。n n 反应包括反应包括:变性变性(Denature)(Denature)、退火退火(Anneal)(Anneal)和延伸和延伸(Extension)(Extension)三个基本步骤。三个基本步骤。n n这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的环将使目的DNADNA扩增一倍，这些经合成产生的扩增一倍，这些经合成产生的DNADNA又可作为下一轮循环的模板，所以经又可作为下一轮循环的模板，所以经25253535轮循环就可使轮循环就可使DNADNA扩增达扩增达10106 6 倍。倍。加热加热加热加热变变 性性复复性性复复温温DNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用可以使可以使可以使可以使 DNADNADNADNA双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断裂裂裂裂,双链解离双链解离双链解离双链解离,形成单链形成单链形成单链形成单链DNA,DNA,DNA,DNA,这称为这称为这称为这称为 DNADNADNADNA的变性的变性的变性的变性。解除变性的条件后解除变性的条件后解除变性的条件后解除变性的条件后,变变变变性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来,形成双链形成双链形成双链形成双链,其原有的特性和其原有的特性和其原有的特性和其原有的特性和活性可以恢复活性可以恢复活性可以恢复活性可以恢复,这称这称这称这称DNADNADNADNA复性复性复性复性,也叫退火也叫退火也叫退火也叫退火。PCRPCR扩增原理扩增原理延伸延伸延伸延伸变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 变性变性变性变性退火退火退火退火3 3 5 5 延伸延伸延伸延伸n n变性变性：加热，使模板：加热，使模板DNADNA在高温下（在高温下（9494）变性，）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。n n退火退火：溶液温度降至：溶液温度降至45456565，模板，模板DNADNA与引物与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。n n延伸延伸：溶液反应温度升至：溶液反应温度升至7272，耐热，耐热DNADNA聚合酶聚合酶以单链为模板，利用引物的以单链为模板，利用引物的3 3-OH-OH，以反应混合物，以反应混合物中的中的4 4种脱氧核苷三磷酸（种脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）为底物，按）为底物，按5 5 3 3 方向复制出互补方向复制出互补DNADNA，即引物的延伸阶段。，即引物的延伸阶段。PCR的的三个热反应过程三个热反应过程温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、变性、变性、变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。为止。为止。为止。PCR的产量的产量u 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。u DNA产量以指数上升，产量以指数上升，n个循环后，达到个循环后，达到2n拷贝。拷贝。【仪器耗材与试剂仪器耗材与试剂】（一）仪器与耗材（一）仪器与耗材1.PCR1.PCR热循环仪热循环仪2.202.20LL、200L 200L 吸头，吸头，200200LL、500L 500L EPEP管，管，1010LL、50L50L、200L200L移液器移液器移液器移液器3.PCR 3.PCR 电泳仪和电泳槽电泳仪和电泳槽（二）试剂（二）试剂1.1.10PCR Buffer10PCR Buffer；2.2.MgClMgCl2,2,25 mmol/L 25 mmol/L；3.3.dNTPdNTP（其中包括其中包括其中包括其中包括dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP与与与与dTTPdTTP；每种；每种；每种；每种浓度均为浓度均为浓度均为浓度均为10 mmol/L 10 mmol/L）；）；）；）；4.4.正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（10 M/L10 M/L）；）；）；）；5.5.Taq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（1U/L1U/L）；）；）；）；6.6.DNADNA模板模板模板模板 （小鼠基因组（小鼠基因组（小鼠基因组（小鼠基因组DNADNA，100ng/L 100ng/L，反转录反转录反转录反转录cDNAcDNA）；）；）；）；7.7.ddHddH2 2O O 【实验步骤实验步骤】n n1.1.在在在在0.2 mL Eppendorff 0.2 mL Eppendorff 管内配置管内配置管内配置管内配置20 L20 L反应体系反应体系反应体系反应体系：反应物反应物反应物反应物体积（体积（体积（体积（LL）dd Hdd H2 2O O 1212PCRPCR缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 （1010）2 2MgClMgCl2 2 （25 mmol/L25 mmol/L）2 2dNTP dNTP（10 mmol/L 10 mmol/L）1.01.0正向引物正向引物正向引物正向引物 （10 M/L 10 M/L）0.50.5反向引物反向引物反向引物反向引物 （10 M/L 10 M/L）0.50.5Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 1 1模板模板模板模板DNA DNA 1 12.按下述程序进行按下述程序进行PCR扩增扩增:1）94 预变性 3 min；2）94 变性 1 min；3）55 退火 30 sec；4）72 延伸 30 sec；5）重复步骤24,34次；6）72 延伸 5 min；7）4,3min.3.琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果结果n n 配制2琼脂糖凝胶，取10 L扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。4.PCR的反应体系中各组分作用的反应体系中各组分作用DNA 模板模板(template)引物引物(primer)4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸（dNTP）DNA聚合酶聚合酶（Taq）反应缓冲液反应缓冲液Mg2+及某些使酶稳定的辅剂及某些使酶稳定的辅剂质量：要求有较高纯度的质量：要求有较高纯度的DNA样品样品避免反复冻融，防止降解避免反复冻融，防止降解数量数量:25-100ng/20l 1）DNA 模板模板2）引物）引物 与模板与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链的短的单链DNA片段。片段。3）dNTP 4种种 dNTP 用量应均衡，否则会减少用量应均衡，否则会减少 Taq 酶合酶合成的忠实性，增加错配率。成的忠实性，增加错配率。l最初的聚合酶最初的聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶 klenow 片段片段,不耐热，每次加热变性后需重新补加。不耐热，每次加热变性后需重新补加。聚合温度偏低（聚合温度偏低（37 ），产生非特异性扩增），产生非特异性扩增lTaq DNA 聚合酶聚合酶 从水生栖热菌中分离，可在从水生栖热菌中分离，可在70-75生长。生长。Taq 酶扩增效率酶扩增效率:600bp/min 错配率错配率:1bp/4000bp(无无3-5外切酶活性外切酶活性)4）DNA聚合酶聚合酶作用作用:增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增加增加 dsDNA 的的 Tm 值，提高融合温度。值，提高融合温度。与游离与游离 dNTP 形成可溶性复合物，有利形成可溶性复合物，有利 dNTP 渗入。渗入。浓度浓度:1.5-2.0 mmol/l5）缓冲液中的）缓冲液中的Mg2+6）循环次数循环次数 循环次数是循环次数是2535次。次。循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增加。加。5.PCR反应常见问题反应常见问题1.1.没有任何产物：没有任何产物：没有任何产物：没有任何产物：模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加 引物设计，浓度引物设计，浓度引物设计，浓度引物设计，浓度 MgMg2+2+浓度太低浓度太低浓度太低浓度太低 变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等2.2.产生多个条带：产生多个条带：产生多个条带：产生多个条带：引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高 Mg2+Mg2+浓度太高浓度太高浓度太高浓度太高 酶用量太多酶用量太多酶用量太多酶用量太多 退火温度过低等退火温度过低等退火温度过低等退火温度过低等3.3.产生与目的片段长度相似的非目的片段产生与目的片段长度相似的非目的片段产生与目的片段长度相似的非目的片段产生与目的片段长度相似的非目的片段:模板或者试剂不纯，有其他基因组污染模板或者试剂不纯，有其他基因组污染模板或者试剂不纯，有其他基因组污染模板或者试剂不纯，有其他基因组污染4.4.出现片状拖带：出现片状拖带：出现片状拖带：出现片状拖带：模板，酶，模板，酶，模板，酶，模板，酶，dNTPdNTP用量太大，循环次数过多用量太大，循环次数过多用量太大，循环次数过多用量太大，循环次数过多谢谢 谢！谢！