分子生物学05基因功能研究方法.pptx

分子生物学研究法分子生物学技术体系n一一.基本技术基本技术n二二.基因基因(狭义狭义)及产物及产物 分子检测技术分子检测技术n三三.基因基因(狭义狭义)及产物及产物 获取技术获取技术n四四.基因基因(广义广义)功能研究技术功能研究技术一一.基本技术基本技术1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE 电泳电泳3.PCR技术技术4.细菌转化细菌转化1.琼脂糖凝胶电泳n1、原理：、原理：n2、用途：、用途：琼脂糖凝胶电泳的原理 1.DNA电泳迁移电泳迁移：电荷效应分子筛效益电荷效应分子筛效益 （1）DNA带负电，电场中，向正极移动；（2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型；(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比；（分子量越大，跑得越慢）2、检测原理、检测原理：（1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。琼脂糖凝胶电泳用途n1.DNA分子量测定（距离分子量）n2.基因，克隆的鉴定（通过1完成）n3、不同长度的基因片断的分离n4、DNA浓度的测定 （荧光的强度与DNA含量成正比）n加标准分子量加标准分子量DNA Marker,测定分子量测定分子量n加标准浓度的加标准浓度的DNA，测定浓度，测定浓度2.SDS-PAGE 电泳1、原理2、用途SDS-PAGE 电泳原理n1.SDS(带负电带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时同时SDS与蛋白定量结合与蛋白定量结合,消除蛋白之间的电消除蛋白之间的电荷差异荷差异,使得使得蛋白的迁移率主要依赖分子量蛋白的迁移率主要依赖分子量 (分分子小跑得快子小跑得快).).n2.2.不连续电泳不连续电泳:上层为浓缩胶上层为浓缩胶,可将样品压缩到可将样品压缩到同一起跑线同一起跑线,下层为分离胶下层为分离胶;可获得更高的分可获得更高的分辨率辨率.n3.3.考马斯亮蓝进行染色考马斯亮蓝进行染色.SDS-PAGE 电泳用途n1.蛋白分子量的测定n2.蛋白浓度的测定n3.蛋白的鉴定(通过1来实现)3.PCR(聚合酶链式反应)技术 PCR的基本原理的基本原理变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制 PCR三步曲三步曲n变性变性 9097n退火退火 4555n延伸延伸 72PCR4.细菌转化n通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内；n当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。n感受态细胞的活性较低，处理需温柔。二二.基因基因(狭义狭义)及产物及产物 分子检测技术分子检测技术 -定性定性,定量定量,定位定位1.DNA(分子量和序列分子量和序列)(1)(酶切)电泳;(2)PCR;(3)Southern blot;(4)染色体原位杂交 (5)测序;2.RNA(序列序列)(1)RT-PCR (2)Northern blot (3)RNA原位杂交(4)DNA芯片技术;(5)基因表达系列分析技术（SAGE)3.蛋白蛋白(分子量分子量,结合特性结合特性,酶学特性酶学特性)(1)SDS-PAGE;(2)质谱技术;(3)Western blot;(4)ELISA;(5)蛋白芯片技术;(6)免疫组化(7)EMSA;(8)免疫共沉淀技术 CoIP;(9)蛋白质磷酸化分析Southern blot名称名称检测对象检测对象探针探针检测原理检测原理处理过程处理过程用途用途Southern blotDNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性琼脂糖电泳后转膜基因检测（拷贝数）Northern blotRNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性变性琼脂糖电泳后转膜基因表达的检测（表达量）Western blot蛋白抗体抗原抗体特异性结合SDS-PAGE后转膜基因表达产物蛋白的检测DNA检测检测Southern blotSouthern blot原位杂交技术原位杂交技术n通过标记的核酸探针通过标记的核酸探针,在组织在组织,细胞细胞,间期核及染间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段手段.n(1)RNA原位杂交-组织切片中,该基因的表达产物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析.-区别 免疫组化(蛋白)(2)染色体原位杂交-eg.荧光原位杂交(FISH),确定DNA序列染色体上的位置.DNA/RNA 检测检测双脱氧法测序双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1.原理：Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反 应物中加入一定量的 2,3ddTTP 时，因ddT 的3碳原子不含OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.DNA检测检测Northern blotRNA检测检测生物芯片技术生物芯片技术 n生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。DNA/RNA/Protein 检测检测主要特点主要特点 n高通量、微型化和自动化高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。但目前的成本较高，重复性较差。生物芯片分类生物芯片分类(1)-用途1.样品制备芯片2.生化反应芯片（如PCR芯片）3.检测芯片（如基因芯片，蛋白芯片）4.芯片实验室（是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统）。生物芯片分类生物芯片分类(2)-制造技术 微孔板/微阵列芯片DNA微点阵(阵列)芯片 此类芯片的共同特点是,将多达成千上万种探针分子按照一定顺序排列在固相基片(多数采用玻片)上组成密集的微点阵(Microarray)或阵列(Array),利用核酸杂交原理对靶核酸进行检测分析。蛋白质微点阵(阵列)芯片 将大量纯化的蛋白分子按一定的排列规律连接于玻片上,形成密集的微点阵(阵列),进行高通量的生物活性检测、蛋白质 靶标分子(蛋白质、抗体、)相互作用研究。微流路芯片流过式芯片微流路(Microfluidic)芯片的共同特点是采用半导体微加工技术和(或)微电子工艺在芯片上构建微流路系统(由储液池、微反应室、微通道、微电极、微电路中的一种或几种组成),加载生物样品和反应液后,在压力泵或电场的作用下形成微流路,于芯片上进行一种或连续多种的反应,达到对样品的高通量快速分析的目的。微电子芯片PCR芯片毛细管电泳芯片毛细管层析芯片多功能集成芯片蛋白质分析微流路芯片基因表达系列分析技术（基因表达系列分析技术（SAGE)n以测序为基础的定量分析全基因组表达以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息；型细胞或组织的基因表达信息；n理论依据：碱基的核酸片段可理论依据：碱基的核酸片段可代表一种转录产物的特异序列（序列标代表一种转录产物的特异序列（序列标签）签）n某序列标签占总标签数的比例对应编码某序列标签占总标签数的比例对应编码基因的表达频率基因的表达频率RNA检测检测MS质谱技术质谱技术 n质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽的分子量和对蛋白质进行鉴定，磷酸化蛋白质分析、糖基化蛋白质分析等,也能检测核酸的SNP。Protein/DNA 检测检测MALDI-TOF 和 ESI-MSnMALDI基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化，这种质谱仪的特点是可分析分子量分子量较大的分子较大的分子，对杂质的忍耐性较好。nESI-电喷雾质谱仪，通过样品溶液在毛细管喷雾口形成液滴，在强电场和热的干燥气的共同作用下，液滴逐渐被气化，同时也被质子化；喷雾口与离子聚焦传输区之间的压力差推动质子化样品进入质量分析器进行检测。MALDI-TOF MS 分析分析21-aa 肽肽(理论分子量理论分子量 2404)Western blotProtein 检测检测ELISAProtein 检测检测EMSAn凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay)n体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术.n原理:非变性电泳中,核酸蛋白结合后,泳动速度变慢.DNA与与Protein 相互作用检测相互作用检测免疫共沉淀技术(CoIP)n蛋白蛋白-蛋白相互作用蛋白相互作用n常验证酵母双杂交的结果常验证酵母双杂交的结果Protein-protein 相互作用的检测相互作用的检测蛋白质磷酸化分析n蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方式n一般在丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸上磷酸化.n蛋白激酶-磷酸化;蛋白质磷酸酯酶-去磷酸化.n 一般通过双向电泳和质谱分析.n也可通过磷酸化抗体Western blot检测Protein检测检测三三.基因基因(狭义狭义)及产物及产物 获取技术获取技术1.已知基因已知基因(1)酶切,PCR或RT-PCR获得基因;(2)通过常规分离纯化技术或通过基因工程进行克隆和表达基因产物.2.未知新基因未知新基因(1)RACE 技术(2)cDNA文库(3)酵母双杂交(4)酵母单杂交(5)噬菌体展示技术(6)cDNA差示显示法(7)双向电泳+质谱+数据库技术一一.重重组组DNA技技术术概概论论3.1 RACE 技术nRapid amplification of cDNA ends已知基因一端序列,快速获取另一端序列.n5 RACE(获取5序列)3 RACE(获取3序列)n需要合成引物接头(单链DNA),用RNA ligase将基因(RNA)与引物(DNA)连接.5 RACE3 RACE(非mRNA扩增)n合成两条互补的引物,序列任意.及一条序列特异的引物n互补引物中一条5标记 Pi,通过RNA ligase 将其与RNA连接.2.3 cDNA文库一.cDNA:(1)将mRNA反转录为双链DNA.(2)特点:A.稳定;B.无内含子.二.cDNA文库:(1)代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息.(2)特点:A.不同的生物,同一生物不同组织,同一组织不同发育时间或不同生理状态下,cDNA文库不同;B.建好的cDNA文库的具体的信息未知,仅提供钓取相关目的基因的材料.C.每个克隆不一定是全长基因cDNA文库建库过程n1.高质量mRNA的制备;n2.反转录生成cDNAn3.与载体分子连接(噬菌体文库)n4.转染(噬菌体的包装)说明说明:1.引物引物 oligo dT,随机引物随机引物R6 (得到全长得到全长cDNA)2.两端可加上酶切接头两端可加上酶切接头,便于克便于克隆到载体上隆到载体上.3.合成时合成时,原料用甲基化的原料用甲基化的dCTP.防止酶切时损伤内部序列防止酶切时损伤内部序列.4.转化效率要高转化效率要高,防止少量表达防止少量表达的的mRNA未得到克隆未得到克隆.酵母双杂交法（蛋白蛋白相互作用）n1.筛选与已知蛋白相互作用的蛋白基因n2.真核生物的转录激活子基本结构 一般有3个功能域（functional domain）nDNA结合域（DNA-binding domain）DBn转录激活域（transcription-activating domain）-ADn结合其它蛋白或因子的结构域1.“猎物猎物”为一个库；为一个库；将不同的将不同的“诱饵诱饵”克隆后，捕获不同克隆后，捕获不同的的“猎物猎物”.5 酵母单杂交（核酸-蛋白相互作用）n用于鉴定与特定顺式作用元件（DNA序列）作用的转录调控因子的DNA结合域或反之噬菌体展示技术n蛋白-蛋白相互作用n将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，从而使多肽能够展示在病毒颗粒的表面，展示在噬菌体表面的多肽配体与各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速筛选鉴定。噬菌体展示技术构建的文库容量大，可进行多次“淘选”富集，十分适用于高通量筛选，因此可以广泛应用于蛋白质相互作用分析等方面的研究，也是进行多肽药物筛选的重要手段。双向电泳双向电泳 n双向电泳是蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分离方法，同时能分离成百上千种蛋白质。蛋白质在第一向根据电荷的不同（等电聚焦），第二向根据分子量的不同进行分离（SDS-PAGE）。分离后对蛋白质进行染色，根据实际分析情况，分别进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色。扫描后用相关软件（PDQUEST等）进行图谱分析，分析差别点等。双向电泳与质谱技术联用，还可以进一步分析差别点蛋白的特性。四四.基因基因(广义广义)功能研究技术功能研究技术-调控元件功能和表达产物的功能调控元件功能和表达产物的功能1.定点突变技术定点突变技术2.基因打靶基因打靶3.RNAi技术技术4.转基因过表达技术转基因过表达技术5.报告基因技术报告基因技术定点突变n1.研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构,功能的影响;n2.改造DNA调控序列,修饰表达载体,引入新的酶切位点.基因功能研究技术基因功能研究技术TaKaRa mutation kit基因打靶(gene targeting)n通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。(反向遗传学)n基因敲除(gene knockout)：定向敲除n基因敲入(gene knockin)：定向替代基因功能研究技术基因功能研究技术基因打靶的必备条件n胚胎干细胞胚胎干细胞(ES细胞细胞)n能在体外培养，保留发育的全能性n打靶载体打靶载体nNeo（新霉素）阳性筛选标志nHSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因敲除的基本程序n打靶载体的构建n打靶载体导入ES细胞：重组置换n基因敲除ES细胞注射入胚泡n胚泡植入假孕小鼠的子宫中n嵌合体的杂交育种基因敲除 Knockoutn1.完全基因敲除-可能会致死.n2.条件型基因敲除 Cre/LoxP,FLP/FRT基因敲除的缺点n能将基因与表型(生物功能)联系起来,但不能提供具体的作用机制;n对多基因决定的表型无法将其联系全部找出;n操作复杂,成本高.RNAi（RNARNA干扰）干扰）1.1.线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌 2.2.机制：机制：dsRNA诱导产生的细胞内同源基因表达阻断，PTGS也是 RNAi。3.3.生物学功能：生物学功能：细胞内免疫，阻止外源病毒和核酸的入侵，阻断转作子的作用。4.4.应用应用:反相遗传工具，研究基因功能 基因治疗基因功能研究技术基因功能研究技术