仪器及药物分析0833荧光质谱.pptx

五、荧光分子光度法五、荧光分子光度法v（一）基本原理（一）基本原理v（二）荧光分光光度计（二）荧光分光光度计v（三）特点、方法与应用（三）特点、方法与应用荧光（荧光（fluorescence）现象的第一次记录：）现象的第一次记录：1575年，西班牙内科医生和植物学家年，西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，观察到观察到Lignum Nephriticum木头切片的水溶液呈现天木头切片的水溶液呈现天蓝色。蓝色。第一次被提议用于分析：第一次被提议用于分析：1864年，年，Stokes第一次用于分析：第一次用于分析：1867年，年，Goppelsrder根据根据Al-桑色素配合物的荧光，桑色素配合物的荧光，建立了建立了Al3+的荧光测定方法。的荧光测定方法。v当物质分子吸收了一定波长的紫外光能之后，基态当物质分子吸收了一定波长的紫外光能之后，基态 电子跃迁到第一激发态，处于激发态的电子首先以电子跃迁到第一激发态，处于激发态的电子首先以 无辐射的方式下降到第一激发态的低能级，而后再无辐射的方式下降到第一激发态的低能级，而后再 回到基态时，所发射出的光称为荧光。回到基态时，所发射出的光称为荧光。v荧光是一种以光能为激发源的发射光，且波长比激荧光是一种以光能为激发源的发射光，且波长比激 发态波长更长，所以，利用物质的荧光现象而建立发态波长更长，所以，利用物质的荧光现象而建立 的分析方法称为荧光分光光度法。的分析方法称为荧光分光光度法。（一）基本原理（一）基本原理荧光定量分析原理荧光定量分析原理v荧光是由物质在吸收光能之后产生的发射光，其荧光强度荧光是由物质在吸收光能之后产生的发射光，其荧光强度 与物质吸收光能的程度和产生荧光的物质有关。与物质吸收光能的程度和产生荧光的物质有关。v荧光效率荧光效率 反映荧光强度的重要参数反映荧光强度的重要参数v荧光强度荧光强度 If 应与荧光物质的吸光强度应与荧光物质的吸光强度(I0 I)和荧光效率和荧光效率成正比，即成正比，即 If=(I0 I)v根据朗伯根据朗伯 比尔定律，和有关的运算，在一定的条件下，比尔定律，和有关的运算，在一定的条件下，得：得：If=2.3 I0cl =Kc（二）荧光分析光度计（二）荧光分析光度计光源光源激发单色器激发单色器样品池样品池发射单色器发射单色器检测器检测器信号处理信号处理显示显示I0 IfI荧光分光光度计部件荧光分光光度计部件1 1光源：光源：钨灯、汞灯、氙灯、激光钨灯、汞灯、氙灯、激光 激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。度；强度：影响测定的灵敏度。2 2单色器：单色器：滤光片、光栅滤光片、光栅 激发单色器和发射单色器激发单色器和发射单色器3 3检测器检测器PMT PhotomultiplierPMT PhotomultiplierCCD CCD Charge Coupled Device Charge Coupled Device CID CID Charge Injected Device Charge Injected Device 4 4信号处理信号处理JobinYvonFluorolog-3荧光光谱仪荧光光谱仪1.稳态：S/Nmin4000:1(光子计数和全反射光路)2.10us-10s以上(磷光寿命)10ps-10us(荧光寿命)3.波长范围：200-900nm(UV-VIS-NIR)4.扫描速度：150nm/sv灵敏度高：灵敏度高：比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高24个数量级；个数量级；检测下限：检测下限：0.10.1 g/cm-3 相对灵敏度：相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05M H2SO4)v选择性高选择性高v重现性好重现性好v取样量少取样量少v仪器不复杂仪器不复杂（三）荧光分析方法的特点、方法及应用1特点2方法及应用检测：金属离子、有机物、生物分子检测：金属离子、有机物、生物分子生物分子相互作用研究生物分子相互作用研究疾病诊断疾病诊断 定性分析：定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度 呈线性关系。呈线性关系。分析方法分析方法直接荧光法（能产生较强荧光的药物）直接荧光法（能产生较强荧光的药物）间接荧光法（不能产生荧光或荧光很弱的药物）间接荧光法（不能产生荧光或荧光很弱的药物）六、有机质谱法六、有机质谱法1.质谱基本知识质谱基本知识v质谱仪质谱仪v质谱分析原理质谱分析原理v质谱图质谱图2.离子峰的主要类型离子峰的主要类型3.有机质谱中的裂解反应有机质谱中的裂解反应4.有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图质谱法质谱法将将化化合合物物分分子子在在高高真真空空条条件件下下，用用高高能能电电子子轰轰击击或或强强电电场场使使其其电电离离，电电离离产产物物按按质质荷荷比比(m/z)大大小小进行分离记录所得图谱即所谓的质谱图。进行分离记录所得图谱即所谓的质谱图。基峰基峰高真空条件高真空条件 10-4-10-6 Pa质荷比质荷比 质量质量/电荷电荷 分离分离 聚焦聚焦电离电离 电场或高能电子轰击电场或高能电子轰击(70ev,6,000KJ.mol-1)Me-M2e-（1）质谱计）质谱计 质谱计须有质谱计须有进样系统、电离系统、质量分析器和检测记录系统进样系统、电离系统、质量分析器和检测记录系统。为了获得良好分析，必须避免离子和气体分子的碰撞，凡有样品为了获得良好分析，必须避免离子和气体分子的碰撞，凡有样品分子及离子存在和通过的地方，都处于分子及离子存在和通过的地方，都处于真空状态真空状态。进样进样系统系统电离电离系统系统质量质量分析器分析器检测记检测记录系统录系统1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.1.电子轰击电子轰击2.2.化学电离化学电离3.3.场致电离场致电离 和场解吸和场解吸4.4.快原子轰击快原子轰击5.5.电喷雾电离电喷雾电离 1.单聚焦 2.双聚焦 高真空系统高真空系统v电子轰击电子轰击 利用高速电子束撞击气态分子，将分利用高速电子束撞击气态分子，将分解出的阳离子高速导入质量分离器中，按质荷解出的阳离子高速导入质量分离器中，按质荷比（比（m/z）的大小顺序收集，并以质谱图记录）的大小顺序收集，并以质谱图记录下来，根据质谱峰位置进行定性和结构分析，下来，根据质谱峰位置进行定性和结构分析，或根据强度进行定量分析。或根据强度进行定量分析。v化学电离化学电离 高能电子束和小分子反应气体，甲烷高能电子束和小分子反应气体，甲烷等，反应生成初级离子，等，反应生成初级离子，CH4+.，再和样品分子，再和样品分子反应，使之电离。反应，使之电离。v强致电离强致电离 电场作用下，汽化样品分子的电离电场作用下，汽化样品分子的电离v场解吸场解吸 不需要汽化，将样品吸附在处理过的不需要汽化，将样品吸附在处理过的金属尖端，通以微电流，金属成为场离子发射金属尖端，通以微电流，金属成为场离子发射体，使样品解吸，离子化。体，使样品解吸，离子化。v快原子轰击快原子轰击 高能原子束轰击，采用基质负载高能原子束轰击，采用基质负载样品，用于不稳定的极性分子。样品，用于不稳定的极性分子。v电喷雾电离电喷雾电离 样品溶液在强静电场作用下形成样品溶液在强静电场作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，溶剂不断挥发，液带高度电荷的雾状小液滴，溶剂不断挥发，液滴裂分，最终形成带电离子，可用于分子量大滴裂分，最终形成带电离子，可用于分子量大于于20000的生物分子和络合物分析。的生物分子和络合物分析。离子源离子源离子源离子源重离子重离子重离子重离子路径路径路径路径离子收集器离子收集器离子收集器离子收集器离子源结构离子源结构（2 2）质谱分析原理）质谱分析原理质质谱谱仪仪是是利利用用电电磁磁学学原原理理，使使带带电电的的样样品品离离子子按按质质荷荷比比进进行行分分离离的的装装置置。离离子子电电离离后后经经加加速速进进入入磁磁场场中，其动能与势能相等，即中，其动能与势能相等，即 (1/2)m 2=z U 质量为质量为m,电荷为电荷为z的正电荷离子，经外加电场的正电荷离子，经外加电场U的加速，的加速，离子的运动速度为离子的运动速度为。在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行；在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行；向心力向心力=离心力离心力；Hz =m 2/R 质谱方程式：质谱方程式：m/z=(H2 R2)/2U 离子在磁场中的轨道半径离子在磁场中的轨道半径R取决于：取决于：m/z、H、U向心力向心力=离心力；离心力；Hz =m 2/R固定固定U值值，将将H由小到大连续由小到大连续改变改变,在狭缝收集的离子的在狭缝收集的离子的m/z 比也由小到大地改变。比也由小到大地改变。单聚焦质谱计单聚焦质谱计双聚焦质谱计双聚焦质谱计各各种种峰峰表表示示不不同同质质/荷荷比比的的离离子子；纵纵坐坐标标以以相相对对丰丰度度表表示示，峰峰越越高高表表示示形形成成的的离离子子越越多多；（即即谱谱图图中中以以最最强强峰峰高高为为100%，分别计算其他峰强度），分别计算其他峰强度）（3）质谱图）质谱图基峰基峰：质谱图中离子强度最大的峰：质谱图中离子强度最大的峰六、有机质谱法六、有机质谱法1.质谱基本知识质谱基本知识2.离子峰的主要类型离子峰的主要类型v分子离子峰分子离子峰v同位素离子峰同位素离子峰v碎片离子峰碎片离子峰v重排离子峰重排离子峰v两价离子峰两价离子峰3.有机质谱中裂解反应有机质谱中裂解反应4.有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图（1）分子离子峰）分子离子峰质质谱谱信信号号十十分分丰丰富富。分分子子在在离离子子源源中中可可以以产产生生各各种种电电离离，即同一种分子可以产生多种离子峰，其中比较主要的有即同一种分子可以产生多种离子峰，其中比较主要的有分子离子峰、重排离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰分子离子峰、重排离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰等。等。试样分子在高能电子撞击下失去一个价电子，即试样分子在高能电子撞击下失去一个价电子，即Me-M2e-生成的离子称为分子离子或母离子。其中生成的离子称为分子离子或母离子。其中“+”代表代表正离子，正离子，“.”代表不成对电子。代表不成对电子。分子离子的质量与化合物的分子量相等。分子离子的质量与化合物的分子量相等。分子离子分子离子母离子母离子奇电子离子奇电子离子碎片离子碎片离子+.质谱图上哪个是分子离子峰，哪个是基峰？质谱图上哪个是分子离子峰，哪个是基峰？思考！思考！1301305757292987871011014141有机化合物分子离子峰的相对强度：有机化合物分子离子峰的相对强度：在质谱中，分子离子峰的强度和化合物的结构有关。环在质谱中，分子离子峰的强度和化合物的结构有关。环状化合物比较稳定，不易碎裂，因而分子离子较强。支状化合物比较稳定，不易碎裂，因而分子离子较强。支链较易碎裂，分子离子峰就弱，有些稳定性差的化合物链较易碎裂，分子离子峰就弱，有些稳定性差的化合物经常看不到分子离子峰。经常看不到分子离子峰。芳香化合物共轭链烯烯烃脂环化合物芳香化合物共轭链烯烯烃脂环化合物直链烷烃酮胺酯醚酸支链烷直链烷烃酮胺酯醚酸支链烷烃醇烃醇M=93律律分子中若含有偶数个氮原子，分子中若含有偶数个氮原子，则相对分子质量将是偶数；反之，将是则相对分子质量将是偶数；反之，将是奇数。这就是所谓的奇数。这就是所谓的“氮律氮律”。例如：例如：CH4 M=1612C+1H4=164=16 M13C+1H4=17 M+14=17 M+112C+2H+1H3=17 M+13=17 M+113C+2H+1H3=18 M+23=18 M+2同同位位素素峰峰分子离子峰分子离子峰（2）同位素离子峰（）同位素离子峰（M+1峰）峰）由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个质量单由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰；有时还可以观察到位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3.；1615m/z RA13.1121.0133.9149.2158516100171.1m/z（3）碎片离子峰）碎片离子峰一般有机化合物的电离能为一般有机化合物的电离能为713电子伏特，质谱中常用电子伏特，质谱中常用的电离电压为的电离电压为70电子伏特，过剩的能量使分子离子化学键断裂，电子伏特，过剩的能量使分子离子化学键断裂，产生各种产生各种“碎片碎片”离子。离子。H3CH3CC=O+CH3CH3 CO+CO CH3+M+=58m/z=43m/z=15碎片可以来剖析分子的结构碎片可以来剖析分子的结构常见丢失碎片常见丢失碎片 常见稳定离子常见稳定离子（4）重排离子峰重排离子峰 当分子中裂解为碎片离子时，在键断链的同当分子中裂解为碎片离子时，在键断链的同时，分子内部的原子或基团重排，形成随片离时，分子内部的原子或基团重排，形成随片离子，这种离子产生的质谱峰称为重排离子峰。子，这种离子产生的质谱峰称为重排离子峰。（5）两价离子峰两价离子峰 分子受轰击后，失去两个电子，形成分子受轰击后，失去两个电子，形成M2+离子，离子，M2+离子产生的质谱峰称为两价离子峰。一些杂环、芳环和离子产生的质谱峰称为两价离子峰。一些杂环、芳环和高度不饱和的化合物也易形成两价离子峰，而决大多数高度不饱和的化合物也易形成两价离子峰，而决大多数药物和毒物均有杂环和芳环结构。药物和毒物均有杂环和芳环结构。除上述离子峰外，还可能有亚稳离子峰以及碎片与除上述离子峰外，还可能有亚稳离子峰以及碎片与中性碎片反应形成的离子峰等。对于一张未知化合物的中性碎片反应形成的离子峰等。对于一张未知化合物的质谱图进行解析时，必须慎重、全面考虑。质谱图进行解析时，必须慎重、全面考虑。六、有机质谱法六、有机质谱法1.质谱基本知识质谱基本知识2.离子峰的主要类型离子峰的主要类型3.有机质谱中裂解反应有机质谱中裂解反应v自由基引发的裂解反应自由基引发的裂解反应v自由基引发的重排反应自由基引发的重排反应4 有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图生物质谱生物质谱裂解裂解C-Y或或C=Y（Y=O，N，S）基团的化合物与这些基团相连的）基团的化合物与这些基团相连的化学键断裂。化学键断裂。自由基或电荷定位在分子中某个特定的位置上，然后以自由基或电荷定位在分子中某个特定的位置上，然后以一个电子或电子对的转移来引发裂解反应。一个电子或电子对的转移来引发裂解反应。C的价电子基本上都用于成键；的价电子基本上都用于成键；O，N，S有非键电子有非键电子（1 1）自由基的位置引发的裂解反应）自由基的位置引发的裂解反应裂解裂解CH3(CH2)9CH2NH2M=15730裂解裂解丢失最丢失最大烃基的可能性最大大烃基的可能性最大丢失最大烃基原则丢失最大烃基原则麦氏重排（麦氏重排（Mclafferty rearrangementMclafferty rearrangement)位的位的H 转移到杂原子上，同时转移到杂原子上，同时 键发生断裂，生成一键发生断裂，生成一 个中性分子和一个自由基阳离子个中性分子和一个自由基阳离子（2 2）自由基位置引发的重排反应）自由基位置引发的重排反应键断裂的同时有氢原子发生转移，产生重排离子；键断裂的同时有氢原子发生转移，产生重排离子；六、有机质谱法六、有机质谱法1.质谱基本知识质谱基本知识2.离子峰的主要类型离子峰的主要类型3.有机质谱中裂解反应有机质谱中裂解反应4 有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图v烃类化合物的裂解烃类化合物的裂解v杂原子化合物的裂解杂原子化合物的裂解v常见质谱图常见质谱图（1）烃类化合物的裂解烃类化合物的裂解优先失去大的基团，优先生成稳定的优先失去大的基团，优先生成稳定的正碳离子正碳离子。C C6 6HH5 5CHCH2 2+CHCH2 2=CHCH=CHCH2 2+R R3 3C C+R2CH R2CH+RCHRCH2 2+CHCH3 3+稳定性稳定性稳定性稳定性 直链烷烃直链烷烃正癸烷正癸烷M=14M-29CH3CH2CH2+CH3CH+CH3异构化生成稳定的正碳离子异构化生成稳定的正碳离子有有m/z：29，43，57，71，CnH2n+1 系列峰系列峰M=14M-29基峰为基峰为43或或57 支链烷烃支链烷烃CH3CH2CH2CH2 CH3C+（CH3）2 环烷烃环烷烃环烷烃分子离子峰较强环烷烃分子离子峰较强 烯烃烯烃4141基峰是烯丙基正离子，基峰是烯丙基正离子，M=41CHCH2 2=CHCH=CHCH2 2+芳香烃芳香烃M=14M-29基峰为基峰为43或或57直链烷烃和支链烷烃直链烷烃和支链烷烃质谱图有什么异同之处？质谱图有什么异同之处？支链烷烃有支链烷烃有M-15环烷烃环烷烃分子离子峰较强分子离子峰较强芳香烃芳香烃 苄基正离子一般是基峰（苄基正离子一般是基峰（91）有苯环断裂的特征峰有苯环断裂的特征峰77，65，37.烯烃烯烃的基峰一般是烯丙基正离子，的基峰一般是烯丙基正离子，M=41小小 结结特征：特征：m/z=31+n*14;CH2=OH；出现出现M-18峰峰,失去一分子的水；失去一分子的水；+（2）含杂原子化合物的裂解含杂原子化合物的裂解醇，酚，醚类的裂解醇，酚，醚类的裂解 M-18苄醇：苄醇：M-1峰比较强；峰比较强；m/z=79峰比较特征峰比较特征.苯酚的质谱与苄醇会有什么不同呢？苯酚的质谱与苄醇会有什么不同呢？基峰基峰苯酚苯酚 94的峰强，的峰强，77的峰很弱。的峰很弱。（3）常见质谱图常见质谱图 醚的质谱图醚的质谱图 醛、酮、酸的质谱图醛、酮、酸的质谱图 CH3CH2CH2COOH麦氏重排麦氏重排麦氏重排麦氏重排 其他化合物的质谱图其他化合物的质谱图8644重排重排84H重排重排70例一、推导下列化合物的碎片峰来源：例一、推导下列化合物的碎片峰来源：OC4H9-C-CH3|-C4H9烷基链是什么结构的？烷基链是什么结构的？-C4H9烷基链是什么结构的？烷基链是什么结构的？解析：解析：1100，分子离子峰，分子离子峰285，失去，失去CH3（15）的产物）的产物357,丰度最大丰度最大,稳定结构稳定结构,失去失去C=O(28)后的产物后的产物OC4H9-C-CH3|基峰是基峰是57；43不是强峰，出现不是强峰，出现41强峰，可能是支链烷烃。强峰，可能是支链烷烃。5743CH3CH3CH3C|CO|CH3某化合物某化合物C C4 4H H8 8O O的质谱图如下，试推断其结构，的质谱图如下，试推断其结构，并写出主要碎片离子的断裂过程。并写出主要碎片离子的断裂过程。CH3CH2CCH3O